[發明專利]一種提高臍孢木霉菌合成木霉素的方法

有效

• 申請號: 201410543923.1
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104342461A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 申屠旭萍;袁小楓;俞曉平;劉衛平;湯谷
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N15/80;C12R1/885
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物技術和生物防治領域，特別是涉及一種提高臍孢木霉

菌（Trichoderma?brevicompactum）0248合成木霉素的方法。

背景技術

木霉素（trichodermin）——單端孢霉烯類化合物的一種，該化合物對常見9種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發均有不同程度的抑制作用，對黃瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果，因此被認為是具有廣闊生防應用前景的抗真菌物。木霉素主要由木霉屬真菌臍孢木霉菌（T.?brevicompactum）發酵產生。為了提高木霉素的開發價值和市場競爭力，不少研究者采用物理誘變和誘導等方法以期提高木霉素產量，但在現階段，木霉菌產素水平離工業化進程相距甚遠。研究組從大蒜中分離篩選到一株產木霉素的內生真菌——臍孢木霉菌（T.?brevicompactum）0248，也一直致力于提高木霉素發酵單位的研究。

發明內容

在研究提高臍孢木霉菌0248產素水平的試驗中發現，一株具有潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉化株在含有潮霉素B的培養基中發酵產木霉素的濃度比臍孢木霉菌0248要高。

本發明通過獲得含潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉化菌株，并在液體發酵培養基中加入潮霉素B，從而提高發酵液中木霉素的濃度。該發明為提高木霉素的發酵單位提供了一種可靠的方法。

本發明的目的是針對野生型菌株臍孢木霉菌0248產素水平低的不足，提供一種提高木霉素產素水平的方法；本發明的另一目的是提供了一株高產木霉素的轉化菌株。

本發明所述的臍孢木霉菌0248，分類命名為Trichoderma?brevicompactum。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC?No.?6985。

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本發明目的通過以下技術方案來實現：

1.?以pCAMBIA0380質粒為基礎，通過限制性內切酶酶切和T4?DNA連接酶連接反應，將pSilent-1質粒上的潮霉素B抗性基因連接到pCAMBIA0380質粒的T-DNA區形成新的質粒pCAMBIA0380-H質粒；

2.?通過熱激轉化，將pCAMBIA0380-H質粒轉化至農桿菌AGL-1中，并提取陽性克隆子中質粒，然后通過PCR驗證陽性克隆子是否正確；

3.?將經PCR驗證了的陽性克隆子農桿菌（命名為AP03H）與臍孢木霉菌0248孢子懸液共同培養，使潮霉素B抗性基因轉化并整合至臍孢木霉菌0248中，通過含潮霉素B的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板篩選陽性轉化株，獲得的陽性轉化株（命名為AZ1）；

4.?使用含潮霉素B的液體培養基(培養基組成為：牛肉膏10?g/L，葡萄糖8?g/L，NaCl?2?g/L，潮霉素B?0.1?g/L?)培養AZ1，培養條件為：28?℃，180?r/min，振蕩培養72?h，發酵液經5000r/min離心10min，上清液用于木霉素含量的測定；

5.?木霉素的檢測

方法：采用氣相色譜法測定，色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱（以5?%苯基甲基硅氧烷為固定液，30?m×320?μm×0.25?μm）；檢測器：氫火焰離子檢測器（FID）；檢測器溫度270?℃；進樣口溫度250?℃；柱溫度：程序升溫，初始溫度100?℃，保持5?min，以10?℃/min升溫至260?℃保持5?min；載氣：氮氣；流速1.5?mL/min。

本發明的有益效果：

本發明獲得了含有潮霉素B抗性基因的臍孢木霉菌轉化菌株AZ1，該菌株在含潮霉素B的液體培養基中木霉素產量為野生型菌株的6.1倍，顯著提高了發酵液中木霉素的濃度，這為木霉素產量的提高提供了一種可靠的方法。

附圖說明

圖1?質粒pCAMBIA0380-H構建流程圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明提高木霉素產量的方法作進一步描述。

實施例1?(含潮霉素B抗性基因片段質粒的制備)

按以下步驟進行：

（1）使用LB培養基在37?℃，180?r/min的條件下培養pSilent-1及pCAMBIA0380質粒的宿主菌，12?h后采用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，分別提取pSilent-1及pCAMBIA0380質粒。