[發明專利]一種基因敲除載體在臍孢木霉菌基因功能研究中的應用

有效

• 申請號: 201410543570.5
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104357471A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 袁小楓;申屠旭萍;俞曉平;湯谷
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/68;C12R1/885
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技術領域

本發明涉及分子生物學和生物技術領域，特別是涉及一種基因敲除載體質粒在臍孢木霉菌（Trichoderma?brevicompactum）基因功能研究中的應用。

背景技術

臍孢木霉菌是一種廣泛存在于土壤、植物中的木霉菌。木霉菌主要通過拮抗作用、競爭作用以及抗生作用等，對常見的多種病原真菌具有抑制作用，如黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia?solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis?cinerea）和黃瓜枯萎病菌（Fusarium?oxysporum）等，因而具有良好的生防應用前景。木霉素（Trichodermin）——單端孢霉烯類化合物的一種，它對常見9種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發均有不同程度的抑制作用，對黃瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果。據報道，木霉素主要由臍孢木霉菌合成，但目前木霉素在臍孢木霉菌中的合成途徑尚未明確。探明木霉素的合成途徑，對木霉素的工業生產和應用具有重要意義。

研究發現單端孢霉烯類化合物代謝途徑中的相關基因大多位于tri基因簇中。鐮刀菌（Fusarium）中tri基因簇的研究較多，該基因簇中大多基因的功能已經知曉，然而tri14基因功能尚未明確。葦狀木霉（T.?arundinaceum）也能合成單端孢霉烯類化合物Harzianum?A（HA）。木霉素和HA的結構非常相似，唯一區別在于C-4位側鏈基團的不同，木霉素C-4位是乙酰基團，HA?上是octa-2,4,6-trienedioic?acid。在T.?arundinaceum中，trichodiene?經加氧、環化、羥基化和乙酰化等4步反應最終合成HA。Tatri4催化3步氧化反應，Tatri11編碼的酶催化C-4羥基化反應（Cardoza?R?E,?Malmierca?MG,??Hermosa?MR,?Alexander?NJ,?McCormick?SP,?Proctor?RH,?Tijerino?AM,?Rumbero?A,?Monte?E,?Gutierrez?S.?Identification?of?Loci?and?Functional?Characterization?of?Trichothecene?Biosynthesis?Genes?in?Filamentous?Fungi?of?the?Genus?Trichoderma.?Appl?Environ?Microb,2011,77(14):?4867-4877）。臍孢木霉菌中相關基因的功能研究報道很少，除了tri5?基因外，其他基因的功能均有待研究（Tijerino?A,?Cardoza?RE,?Moraga?J,?Malmierca?M?G,?Vicente?F,?Aleu?J,?Collado?I?G,?Gutiérrez?S,?Monte?E,?Hermosa?R.?Overexpression?of?trichodiene?synthase?gene?tri5?increases?trichodermin?production?and?antimicrobial?activity?in?Trichoderma?brevicompactum.?Fungal?Genet?Biol,?2011,48:285-296）。

基因敲除是基因功能研究中最具有說服力的方法之一。傳統基因敲除質粒載體構建方法是將待敲除基因上游，下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分別通過酶切和連接的方法克隆到基因敲除骨架載體的多克隆位點上。傳統構建基因敲除質粒，有兩個弊端：（1）構建一個完整的基因敲除質粒，至少要做三次克隆，每一次克隆都需要重復酶切和連接轉化等繁瑣步驟，降低了工作效率；（2）只能選擇在骨架載體多克隆位點中所對應的限制性內切酶，且選擇的內切酶不能在待敲除基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中存在相應的酶切位點。而在實際操作中，在基因的上、下游DNA片段和抗生素抗性基因中可能存在較多的酶切位點序列，導致在多克隆位點中很難找到相對應的內切酶，限制了其應用。

發明內容

本發明從臍孢木霉菌0248菌絲體中提取基因組，利用融合PCR方法構建tri14基因敲除載體，并將該載體應用于tri14基因的敲除以及該基因功能的研究。