[發明專利]一種利用幼胚拯救獲得八仙花種間雜種的方法

在審

• 申請號: 201410543567.3
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN105494078A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 楊玉勇
• 申請（專利權）人: 楊玉勇;張啟翔;蔡明
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用幼胚拯救獲得八仙花種間雜種的方法，包括以下步驟：

A、子房消毒：將授粉后60-75天的未完全發育子房切割下來，在0-8℃溫度條件下，存放24-72小時后取出，用濃度為75%的酒精對其表面擦拭2-3次，流水沖洗2-6小時，帶到超凈工作臺上；用75%的酒精浸泡30秒，0.05-0.1%升汞溶液中浸泡8-15min，用無菌水清洗5-6遍，選取膨大的子房，用無菌刀片切去子房基部。

2.B、接種：在無菌條件下，將滅菌后切去基部的子房接種到1/2MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0；培養溫度為21-26℃，光照強度為2000-2500Lx，光照時間12-14h/d，空氣濕度70-85%，培養30-45天后萌發率達到30-40%。

3.C、增殖培養：將萌發的幼胚接種到1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5-1.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0；培養溫度為21-26℃，光照強度為2000-2500Lx，光照時間12-14h/d，空氣濕度70-85%的條件下進行幼苗的增殖培養，30-45天轉接一次。

4.D、生根培養：將增殖獲得的無菌幼苗轉接到1/2MS+IBA0-0.5mg/L+AC0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，滅菌前PH調整到5.8-6.0；培養溫度為21-26℃，光照強度為2000-2500Lx，光照時間12-14h/d，空氣濕度70-85%的條件下進行生根培養，30-45天后統計生根率為100%。

5.E、雜種鑒定：對獲得材料同時進行形態學鑒定和雜種SSR鑒定，其中：在形態學鑒定時，對雜種的父母本及后代材料的形態學進行觀察和統計，包括：依據英國皇家園藝學會色譜比色，對父母本及開花后代的花色進行比對并記錄；每株隨機選擇三片完全展開的葉片，進行葉長和葉寬的測定，并分別測定葉柄的長度；每株隨機選擇三個完全盛開的花序，測量其花序的長寬，并記錄每個花序的著花數；每個花序隨機選擇五多單花，測量其單花的長度和寬度；每株隨機選擇五個花瓣，對花瓣長度和寬度進行測量。

6.其中花色與父母本的花色均不同，葉片長寬比、花瓣長度、寬度、長寬比及花序長寬比介于父母本之間的初步確定為真雜種。

7.在雜種SSR鑒定時，提取親本及獲得的雜交后代的DNA，對獲得的DNA質量進行鑒定，接著進行PCR擴增及瓊脂凝膠電泳獲得擴增譜帶，并對PCR產物進行檢測，然后使用全自動ABI3730DNA自動測序儀對PCR產物進行STR分型。

8.根據SSR引物擴增條帶讀數結果，擴增結果較清晰反映出有子代發生重組現象；然后通過分析SM匹配系數進行的UPGMA法聚類結果發現無一子代與親本相似系數為1，即無一子代與親本完全相同。

9.而各子代之間的相似性系數變化范圍在0.47-0.93，體現出各個子代間都存在一定的差異。

10.最后我們可以確定14個雜種子代為真雜種。