[發明專利]編碼生物膜形成抑制蛋白質的基因和使用具有失活基因的細菌菌株生產L-賴氨酸的方法

有效

• 申請號: 201410543331.X
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104561050B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 河云煥;金容材;李政訓;申喜星;文準玉;金亨俊;李光鎬
• 申請（專利權）人: CJ第一制糖株式會社
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N1/20;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

本發明涉及源自棒桿菌細菌的新的分離的基因(多核苷酸)，其編碼具有生物膜形成抑制活性的蛋白質；其中多核苷酸失活的產L?賴氨酸的菌株；和使用其生產L?賴氨酸的方法。

技術領域

本發明涉及新的分離的基因，其編碼具有生物膜形成抑制活性的蛋白質，和通過使用其中該基因失活的細菌菌株生產L-賴氨酸的方法。

背景技術

細菌與其他微生物競爭養分，同時在各種生長條件下生長。當細菌的生長條件不利并且威脅它們的生存時，細菌使用各種生存機制，包括生物膜形成。

生物膜是封裝在自生產的細胞外聚合物基質的微生物的裝配體，其充當協同聚生體。生物膜用作保護屏障并且使得細菌在不利的條件下比如抗生素處理、宿主免疫應答和抗菌劑下，作為群落在生物膜中存活。

據報道，隨著細菌質量增加，L-賴氨酸生產產率下降。因此，問題是L-賴氨酸生產產率取決于細菌質量的改變。

在許多實驗之后，本發明的發明人已經成功鑒定了與生產L-賴氨酸的細菌菌株中抑制生物膜形成相關的基因。他們也發現菌株的生長速度可通過失活該基因而增加，導致細菌質量的增加。出人意料地，他們也發現盡管細菌質量增加，L-賴氨酸生產的產率根本不減少，從而完成本發明。

發明內容

本發明的目標是提供新的分離的基因，其在產L-賴氨酸的菌株中編碼具有生物膜形成抑制活性的蛋白質；產L-賴氨酸的菌株，其中該基因被失活；和通過使用具有失活的該基因的產L-賴氨酸的菌株生產L-賴氨酸的方法。

附圖簡述

圖1顯示從培養至靜止期的革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌獲得的在無細胞培養發酵液處理之后NCgl0350基因(SEQ ID NO：2)的啟動子表達水平生長允許試驗的結果。使用的革蘭氏陰性細菌是根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(At)、大腸埃希桿菌(Escherichia coli)(Ec)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Pa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)(St)和哈維氏弧菌(Vibvrio harveyi)(Vh)，并且革蘭氏陽性細菌是枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis Bacillus subtilis)(Bs)、產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)(Ca)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)(Ms)、分枝桿菌菌株(Mycobacterium sp.strain)JC1(MJC1)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Sa)和枯草芽孢桿菌納塔爾鏈霉菌(Bacillus subtilisStreptomyces natalensis)(Sn)。

圖2(a)顯示制備用于測量與NCgl0350基因類似的銅綠假單胞菌PA5238的啟動子表達水平的pHS1004載體的方法，其中通過將啟動子PA5238連接至pDN19lacΩ載體的無啟動子lacZ基因的上游來制備載體pHS1004載體。

圖2(b)顯示PA5238的啟動子表達與無細胞培養發酵液的濃度成比例誘導。無細胞培養發酵液獲自靜止期的培養液，其中銅綠假單胞菌用pHS1004載體轉導。

圖2(c)顯示用于測量在用pHS1004載體轉導的銅綠假單胞菌中PA5238基因表達需要的無細胞培養發酵液的處理時間。

圖3顯示用pHS1004載體轉導的銅綠假單胞菌中PA5238基因的啟動子表達被通過使用獲得自靜止期的細菌培養液的無細胞培養發酵液誘導。細菌已經誘導在圖1中使用的細菌中NCgl0350基因的啟動子表達。使用的革蘭氏陰性細菌是大腸埃希桿菌(Ec)、鼠傷寒沙門氏菌(St)，和使用的革蘭氏陽性細菌是枯草芽孢桿菌(Bs)、谷氨酸棒桿菌(Cg)、恥垢分枝桿菌(Ms)、分枝桿菌菌株JC1(MJC1)和金黃色葡萄球菌(Sa)。