[發(fā)明專利]一種粗榧生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410542941.8
• 申請日: 2014-10-15
• 公開（公告）號: CN104293853B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王祖華;王安亭;李永程;陳華軍;黃向東;王佳偉
• 申請（專利權(quán)）人: 洛陽理工學(xué)院
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18
• 代理公司: 洛陽公信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)41120
• 代理人: 苗強

1.一種粗榧生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)方法，選取多年生粗榧的根、莖、葉作為外植體，經(jīng)切條、滅菌后放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其長出粗榧共生菌，然后對粗榧共生菌按照菌種不同進行分離并分別培養(yǎng)發(fā)酵，將發(fā)酵液濃縮后篩選以獲得可代謝粗榧生物堿的菌種，并進行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離出發(fā)酵液，經(jīng)醇降、抽濾和干燥即制得粗榧生物堿，其特征在于：所述粗榧共生菌分別培養(yǎng)發(fā)酵的具體操作方法為將粗榧共生菌活化后放入溫度為26℃的環(huán)境中培養(yǎng)48h，根據(jù)不同菌種的菌落特征鑒定出各菌種，再將各菌種分別接種到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待菌種代謝產(chǎn)生代謝物1-2天后接入第二批菌種，以促進第二批菌種的生長，第二批接種的菌種長出后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)，然后把搖瓶放入轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為28℃的搖床上培養(yǎng)5d，收集各菌種的發(fā)酵液即可；其中，所述發(fā)酵液濃縮的具體操作方法為將各菌種的發(fā)酵液分別放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中離心，收集上清液，把上清液放入轉(zhuǎn)速為10000r/min的冷凍高速離心機中再次離心，然后把再次離心后的上清液放入溫度為40-50℃、壓強為0.05Mpa的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的十分之一，再將各菌種的濃縮液分別放入溫度為4℃的冰箱內(nèi)即可；

所述發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作方法為將篩選出的可代謝粗榧生物堿的菌種活化，之后接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶內(nèi)培養(yǎng)5d，然后放入發(fā)酵種子罐中經(jīng)四級發(fā)酵即可；

所述醇降、抽濾的具體操作方法為將分離的發(fā)酵液在溫度為40-50℃下打入真空濃縮罐內(nèi)濃縮至原體積的二十分之一，再把濃縮液打入裝有體積濃度為95%的乙醇醇降罐內(nèi)醇降24h，且濃縮液與乙醇的體積比為1:10，制得醇降產(chǎn)物，將醇降產(chǎn)物注入抽濾缸內(nèi)抽濾，制得結(jié)晶產(chǎn)物，然后將結(jié)晶產(chǎn)物打入裝有體積濃度為95%的乙醇醇降罐內(nèi)重復(fù)上述醇降、抽濾過程2-3次后收集結(jié)晶產(chǎn)物即可；

所述搖瓶內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgSO₄、KH₂PO₄和水制成，且各組分的質(zhì)量百分比為土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%， MgSO₄ 0.05%， KH₂PO₄ 0.15%，余量為水，培養(yǎng)基的pH=7；所述土豆汁由組分A和組分B按照10:1的重量比混合后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至原體積的三分之一后制得，所述組分A是將土豆切碎后放入溫度為95-100℃的鍋中蒸煮20-30min，取出后過100-200目篩，收集濾液制得；所述組分B是將土豆切碎后放入榨汁機中壓榨，再把榨汁過80-100目篩，收集濾液制得。