[發(fā)明專利]一種制備BMP?2蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410541699.2
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN104357519B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張東剛;楊建軍;彭繼學(xué)
• 申請（專利權(quán)）人: 煙臺正海生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/70
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,何葉喧

1.一種制備BMP-2蛋白的方法，包括如下步驟：

將種子液按10％的體積比接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，然后按照如下參數(shù)進行第一階段發(fā)酵：

培養(yǎng)溫度：37.0℃；

培養(yǎng)階段溶氧：>40％；

培養(yǎng)pH：7.0-7.3；

接種種子液后的起始溶氧：>90％；

接種種子液后的起始轉(zhuǎn)速：200rpm；

接種種子液后的起始通氣量：3.0SLPM；

待發(fā)酵體系的OD_600nm值為9時加入IPTG并使其濃度為1.0mM，然后按如下參數(shù)進行第二階段發(fā)酵，第二階段發(fā)酵即誘導(dǎo)發(fā)酵：

誘導(dǎo)溫度：37.0℃；

誘導(dǎo)發(fā)酵階段溶氧：>40％；

誘導(dǎo)發(fā)酵階段pH：7.20-7.40；

誘導(dǎo)發(fā)酵時間：4-6小時；

包括第一階段發(fā)酵和第二階段發(fā)酵在內(nèi)的發(fā)酵過程中，采用補料培養(yǎng)基進行補料；

所述方法中，“采用補料培養(yǎng)基進行補料”的方案如下：對于裝有3L所述發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐來說，從發(fā)酵體系OD_600nm＝1.5開始補料，初始補料速度為2ml/min，每半小時增加0.4ml/min，增加至6ml/min后再每半小時減少0.4ml/min，直至補料速度為0；

所述方法中，“采用補料培養(yǎng)基進行補料”的方案如下：對于裝有30L所述發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐來說，從發(fā)酵體系OD_600nm＝1.5開始補料，初始補料速度為12ml/min，每半小時增加2.4ml/min，增加至36ml/min后再每半小時減少2.4ml/min，直至補料速度為0；

所述BMP-2蛋白如序列表的序列1所示；

所述種子液為OD_600nm值＝3.0-5.0的重組菌菌液；所述重組菌的制備方法如下：將具有所述BMP-2蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下：1.0g/100mL胰蛋白胨、0.5g/100mL酵母粉、0.5g/100mL NaCl、0.1g/100mL MgSO₄、0.05g/100mL CaCl₂、0.5g/100mL Na₂HPO₄和0.25g/100mL KH₂PO₄；

所述補料培養(yǎng)基由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下：40g/L甘油、30g/L蛋白胨和15g/L酵母粉。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述BMP-2蛋白的編碼基因如序列表的序列2所示。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述重組質(zhì)粒的制備方法如下：將序列表的序列2自5’末端第64-477位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入載體pET-28a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，得到重組質(zhì)粒。

4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述種子液的OD_600nm值＝4.0。

5.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)發(fā)酵的時間為5小時。