[發明專利]一種用于莫能霉素快速檢測的酶聯免疫試劑盒

在審

• 申請號: 201410534132.2
• 申請日: 2014-10-11
• 公開（公告）號: CN105572362A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 洪霞;戴蔚蔚
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于莫能霉素快速檢測的酶聯免疫試劑盒，其特征在于它包含下列成分：

（1）包被了莫能霉素抗原的酶標板；

（2）莫能霉素抗體；

（3）莫能霉素標準品；

（4）標準品稀釋液；

（5）酶標二抗；

（6）底物顯色液；

（7）洗滌緩沖液；

（8）終止液；

其中，本發明的試劑盒所用試劑的配制方法如下：

（1）莫能霉素標準溶液配制：準確稱取標準莫能霉素1mg，精確到0.00001g，配成1μg/mL標準品溶液母液；使用時，用標準品稀釋液稀釋成所需的濃度（10-1000ng/mL）；

（2）標準品稀釋液為0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，0.9%NaCl的緩沖液；

（3）包被緩沖液為0.1mol/L碳酸緩沖液，pH7.8，含0.05%NaN₃，0.9%NaCl；

（4）封閉液為0.05mol/LTris-HCl溶液，pH8.0，含0.5%BSA，0.9%NaCl，0.04%NaN₃；

（5）洗滌緩沖液為0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，0.9%NaCl，0.04%Tween20；

（6）莫能霉素單克隆抗體工作液：將抗體用pH7.4，0.02mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋成蛋白濃度為0.1-1ug/L使用；

（7）酶標二抗工作液：辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗；

（8）底物顯色液A液：過氧化氫或過氧化脲；

（9）底物顯色液B液：鄰苯二胺（OPD）或四甲基聯苯胺（TMB）；

（10）底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液：pH8.1，含有MgCl₂0.01%100mmol/LTris-HCl；

（11）終止液：2mol/L硫酸。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于包被抗原的制備：將載體蛋白（BSA）的羧基用乙二胺活化，再通過水溶性碳化二亞胺法（EDC）將莫能霉素與活化載體蛋白（BSA）的氨基相偶聯制備莫能霉素抗原。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于莫能霉素單克隆抗體制備：

a、動物免疫程序：采用莫能霉素人工抗原為免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫劑量為50μg，首次免疫為含弗氏完全佐劑的免疫原，頸背部皮下多點注射，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐劑的免疫原加強免疫，前后共四次，可以得到血液里含有莫能霉素特異性抗體的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾細胞

b、細胞融合與克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾細胞，按照5:1的比例與小鼠SP2/0骨髓瘤細胞雜交融合，制備雜交瘤細胞，采用間接競爭酶聯免疫方法測定細胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，篩選能穩定分泌莫能霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株

c、單克隆抗體的制備與純化：采用體內誘生法，將BALB/C小鼠腹腔注入0.5mL滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射雜交瘤細胞，7-10天后采集腹水，經硫酸銨鹽析純化，分裝待用，-20℃保存。