[發明專利]一種表面具有L-手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法

有效

• 申請號: 201410532983.3
• 申請日: 2014-10-11
• 公開（公告）號: CN104307053A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 翁亞軍;范永鴻;王宏;潘夏鑫;黃楠;陳俊英;王進;楊蘋;冷永祥;趙安莎;景鳳娟;趙元聰
• 申請（專利權）人: 西南交通大學
• 主分類號: A61L31/10
• 分類號: A61L31/10;A61L31/08;A61L31/16;A61L33/04
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 張澎

技術領域

本發明涉及生物醫學工程功能材料，尤其是具有優異抗凝血和促內皮細胞粘附、生長功能的材料制備技術領域。

背景技術

心血管器械植入體內后出現的抗凝血性能不足和內皮化延遲所導致的臨床失效問題，已成為制約其應用和發展的難題。兼具抗凝血和促內皮細胞粘附、生長的多功能生物活性材料已成為血液接觸材料發展的趨勢。現有的方法是將抗凝血和促內皮兩類生物活性分子分別固定在材料表面，而選用的抗凝血活性分子，通常是肝素、水蛭素、血栓改性蛋白等生物單分子，類似的方法需要材料表面具有較多的反應性位點，但由于固體材料表面的接枝位點有限、生物大分子的空間位阻大等原因往往難以同時在材料表面實現這兩種功能。

一氧化氮是內皮細胞分泌的信號分子，具有抗血小板激活和聚集、舒張血管等抗凝血功能，已有通過在材料表面固定胱胺、硒代胱胺等催化內源性供體釋放一氧化氮的報道。材料表面或內部固定催化活性分子，類似于酶固定化技術，催化反應要在固體上的催化活性位點發生，而血漿中的蛋白，包括內源性供體，從血漿中吸附到催化活性位點的傳質過程由于受到固體材料的阻礙，實際催化活性往往不高。現有研究表明由氨基酸形成的L-手征性表面(如固定L-半胱氨酸的表面)可以促進蛋白質的表面吸附，因而構建的L-手征性表面能夠加快內源性供體(蛋白質)從液體環境到達催化位點，加速NO的釋放。并且L-手征性表面能夠吸附更多的蛋白，將為粘附的細胞提供更多的營養，從而促進細胞的生長。通過“夾心式”的涂層設計，除了使催化活性層不占用表面接枝位點而外，涂層的最底層和最外層均為聚多巴胺層。聚多巴胺層單獨作為接枝生物分子的連接層，已經有較多的報道，由于其卓越的粘附性能，幾乎能牢固地粘附在所有材料表面，因而這種“夾心式”的涂層設計能夠增加涂層的穩定性和牢固性。聚多巴胺表面主要具有兩類反應性位點，即氨基和醌基。研究顯示材料表面固定促細胞粘附肽往往只需較少的量(約fmol/cm²級別)即可，通過最外層聚多巴胺表面的氨基與促細胞粘附多肽(L-手征性)中的羧基反應而將其固定在表面，以促進內皮細胞的表面粘附。另外，通過聚多巴胺表面醌基固定分子量較小的L-氨基酸或二肽，使材料表面具有較多的L-手征性。

發明內容

本發明的目的是提供一種表面具有L-手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法。以“夾心式”涂層中的聚多巴胺層作為中間連接層，增強涂層粘附的牢固性；以多巴胺與催化活性分子交聯形成催化釋放一氧化氮層；以在涂層表面固定促細胞粘附多肽促進內皮細胞粘附；以在表面接枝小分子L-氨基酸、二肽和促細胞粘附多肽獲得具有L-手征性的表面。

本發明涉及的一種表面具有L-手征性的催化活性多功能生物活性涂層的制備方法，包括如下步驟：

A、將需要改性的基底材料進行拋光、清洗、干燥；

B、將樣品放置于pH＝6-9的Tris緩沖溶液中，然后加入多巴胺，使多巴胺的終濃度為0.01mg/ml-10mg/ml，在10-30℃下，反應1-24h；

C、將樣品用去離子水超聲清洗3次，每次5min，然后用N₂干燥；

D、將C步驟所得樣品置于pH＝6-9的Tris緩沖溶液中，加入多巴胺和具有催化內源性一氧化氮供體釋放一氧化氮的末端含氨基或巰基的化合物，使兩者分別的終濃度為0.01mg/ml-10mg/ml，在10-30℃下，反應1-24h；

E、重復C步驟；

F、重復B、C、D、C步驟1次或多次，然后重復B、C步驟；

G、通過EDC/NHS將含有羧基的促細胞粘附多肽固定在步驟F制備的樣品上：

在濃度為50mM的MES溶液中依次加入含有羧基的促細胞粘附多肽、NHS和EDC，使多肽中羧基量、NHS和EDC三種物質的量的比為1：1：1-5，在10-30℃下，反應1-24h，用蒸餾水清洗3次，每次5min；

H、將G步驟所得樣品置于pH＝6-9的Tris緩沖溶液中，加入L-型氨基酸或L-型二肽，使溶液的終濃度為0.01mg/ml-10mg/ml，在10-30℃下，反應1-24h，蒸餾水清洗3次，每次5min，得到目標材料。

采用本發明方法制備的一種表面具有L-手征性的催化活性多功能生物活性涂層，具有優異的催化人體內源性供體釋放NO的能力，有效地抑制血小板在材料表面的激活和聚集，同時具有較好地促進內皮細胞粘附和生長功能。本發明制備的催化活性層處于涂層內部，而涂層表面接枝的是空間位阻相對較小的氨基酸、二肽或多肽，能夠克服固體表面反應性位點有限的缺陷。