[發(fā)明專利]肉與肉制品中豬源成分的檢測(cè)方法、牛源成分的檢測(cè)方法及羊源成分的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410532343.2
• 申請(qǐng)日: 2014-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN104263836A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯曉林;王蕾;鄭志明;陸彥;孫英健;姚華;張永紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種肉與肉制品中豬源成分的檢測(cè)方法、牛源成分的檢測(cè)方法及羊源成分的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的不斷深入發(fā)展，部分不法商販為了謀求不正當(dāng)利益，在肉或肉制品中摻雜其他價(jià)格便宜的肉種，在肉及肉制品市場(chǎng)出現(xiàn)了一種以次充好、以假亂真的現(xiàn)象。肉或肉制品中摻有標(biāo)稱以外的其他價(jià)格便宜的動(dòng)物源性成分，有的甚至全部為標(biāo)稱以外的其他價(jià)格便宜的動(dòng)物源性成分，這極大地?fù)p害了消費(fèi)者的利益，擾亂了流通市場(chǎng)秩序和健康發(fā)展，同時(shí)也對(duì)民族宗教信仰造成一定的潛在沖突。

傳統(tǒng)一般采用感官方法對(duì)肉或肉制品的色澤、氣味、組織形狀等參數(shù)進(jìn)行判斷，但是其可靠性較差，尤其是添加了色素和芳香劑等添加劑或者經(jīng)過其它加工處理的肉及肉制品而言，感官方法判斷準(zhǔn)確性更低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種肉與肉制品中豬源成分的檢測(cè)方法、牛源成分的檢測(cè)方法及羊源成分的檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)肉與肉制品中豬源成分的試劑盒，包括：如SEQ?ID?No.1所示的上游引物和如SEQ?ID?No.2所示的下游引物。

本發(fā)明以Genbank上已經(jīng)登錄公布的所有豬的Cytb基因序列為基礎(chǔ)，運(yùn)用生物軟件DnaStar進(jìn)行序列比對(duì)分析，找出來自不同國(guó)家、地區(qū)、品種豬、的Cytb基因種內(nèi)保守序列區(qū)域，用于設(shè)計(jì)上下游擴(kuò)增引物，將所設(shè)計(jì)出的各物種PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行再次比對(duì)，排除種間交叉性，保證擴(kuò)增的特異性。同時(shí)，找出豬的Cytb基因序列中共有的同源序列，設(shè)計(jì)哺乳動(dòng)物檢測(cè)引物，用以對(duì)各檢測(cè)體系進(jìn)行監(jiān)控。最后，將獲得的各物種上下游擴(kuò)增引物序列提交Gembank，進(jìn)行Blast確認(rèn)，以確保所設(shè)計(jì)的引物序列對(duì)目前已經(jīng)公布的DNA序列沒有非特異性檢測(cè)擴(kuò)增，并選定上游引物和下游引物。本發(fā)明選用特定的上游引物和下游引物用于檢測(cè)肉與肉制品中的豬源成分，其具有良好的特異性，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)豬源成分的檢測(cè)。

以如SEQ?ID?No.1所示的上游引物和如SEQ?ID?No.2所示的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增位點(diǎn)及擴(kuò)增片段大小如表1所示：

表1豬源成分的擴(kuò)增位點(diǎn)及擴(kuò)增片段大小

所述上游引物的濃度優(yōu)選為0.1μM～0.5μM，更優(yōu)選為0.5μM；所述下游引物的濃度優(yōu)選為0.1μM～0.5μM，更優(yōu)選為0.5μM。

所述試劑盒中還包括DNA聚合酶、10×PCR?Buffer溶液和去離子水，所述DNA聚合酶的濃度優(yōu)選為0.5-1u/μL。所述試劑盒中還包括，所述10×PCR?Buffer溶液具體包括：100mM?Tris-Hcl(pH8.3)，500mMKCl，15mM?MgCl₂。

本發(fā)明還提供了一種肉與肉制品中豬源成分的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

提取肉樣品或肉制品樣品的DNA；

以所述DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的上游引物如SEQ?ID?No.1所示，下游引物如SEQ?ID?No.2所示；

對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，鑒定所述擴(kuò)增產(chǎn)物。

本發(fā)明首先提取肉樣品或者肉制品樣品中的DNA，本發(fā)明對(duì)所述DNA的提取方法沒有特殊限制，小量提取時(shí)可以使用商業(yè)試劑盒提取，大量提取時(shí)可以按照CTAB-NaCl法進(jìn)行提取，具體而言：

小量提取時(shí)，其提取方法為：

a.將稱取的肉糜，放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍完全后快速、用力研磨至粉末狀，研磨時(shí)應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化；

b.將研缽移入65℃水浴，當(dāng)樣品粉末剛開始融化時(shí)，向研缽中加入700μl的Solution?A和1.2μl的Rnase?A，研磨30秒；

c.收集650μl研磨好的組織勻漿至Collection?Tube中。如勻漿體積不足650μl，補(bǔ)充Solution?A至650μl。65℃保溫10分鐘；

d.加入400μl的Solution?B，振蕩混勻；

e.加入1ml的4℃預(yù)冷的Solution?C，充分混勻后，12000rpm離心2分鐘；

f.棄去上層有機(jī)相，再加入1ml的4℃預(yù)冷的Solution?C，充分混勻后，12000rpm離心2分鐘；

g.棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液(無(wú)色下層)轉(zhuǎn)移至置于Collection?Tube上的Filter?Cup中，12000rpm離心1分鐘；