[發明專利]GLP?1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201410531801.0
• 申請日: 2014-10-11
• 公開（公告）號: CN104293834B
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 許必雄;郭頎然;趙紅陽
• 申請（專利權）人: 上海興迪金生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K19/00;C12P21/02;A61K38/26;A61K47/68;A61P3/10
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙)31219
• 代理人: 張艷

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的制備方法。

背景技術

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)可促進胰島素釋放，降低血漿中的胰高血糖素水平，降低胃排空的速率，促進飽食感并刺激胰島的生物合成和β細胞的增殖，可用于2型糖尿病的治療。在我國2型糖尿病發病廣泛，如果不及時加以治療，容易轉變成1型糖尿病，給患者和國家造成很大負擔。因此，開發這類藥物的需求極為迫切。目前美國禮來公司的艾塞那肽(百泌達)和丹麥諾和諾德制藥公司的利拉魯肽(諾和力)已經在我國獲得進口注冊，兩種藥物都具有降血糖和減輕體重的作用，但需要每天1-2次皮下注射給藥。

為了增加的體內半衰期，使GLP-1長效化從而減少單位時間給藥次數已經成為國內外研究的熱點。目前研究的GLP-1及類似物長效化的方法主要有以下三種方式：(1)PEG化長效，代表為Nove Nordisk公司(丹麥諾和諾德公司)研發的每周一次皮下注射的長效GLP-1類似物索瑪魯肽；(2)GLP-1與白蛋白融合蛋白，代表為專利CN10665538A；(3)GLP-1與抗體的Fc片段融合蛋白，代表為專利CN1802386B。禮來公司的GLP-1-Fc(LY2189265)目前正在美國三期臨床階段，根據臨床實驗的數據報道，LY2189265能夠有效增加GLP-1的半衰期，實現每周給藥一次，提高了患者治療的依從性。

重組人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物與具有延長人體內半衰期作用的抗體Fc片段組成的融合蛋白(簡稱GLP-1-Fc)，國外制藥公司將該融合蛋白應用于人體臨床實驗能夠有效的治療2型糖尿病的同時降低體重。

隨著抗體技術的發展，許多上市的抗體類藥物都是在CHO-S或CHO-K1細胞為原始細胞的基礎上構建工程細胞，工業生產中采用高密度細胞培養的方法實現抗體目標蛋白在最終細胞培養液中的高表達。由于抗體分子有分子結構穩定的特點，高密度細胞培養過程中由于部分工程細胞凋亡而釋放出的蛋白酶對抗體目標蛋白影響很小。由于GLP-1-Fc融合蛋白存在抗體Fc片段作為分子的組成部分，其分子具有一些抗體的特性，很多人認為CHO-S或CHO-K1細胞為原始細胞的基礎上構建工程細胞也應當是最方便和合理的選擇。但是，在此技術領域的一些信息得到，該融合蛋白在細胞表達階段會出現不同程度的降解，所降解的GLP-1-Fc在后續分離純化制備中很難去除，不但影響到產品的生物學活性也會嚴重影響產品制備的得率，其原因在于GLP-1-Fc融合蛋白中N端最關鍵的GLP-1部分的31個氨基酸很不穩定，容易被細胞凋亡裂解后釋放的蛋白酶的水解作用而降解。Qiao-Zhen Lu等人在文獻Characterization of the Proteases Involved in the N-Terminal Clipping of Glucagon-Like-Peptide-1-Antibody Fusion Proteins中提到，GLP-1-Fc在CHO-S細胞系中表達最多會出現超過50％的不完整形態，即降解條帶。由于在細胞發酵過程中產生的N-端出現降解的GLP-1-Fc融合蛋白必須在最終藥品的制造過程中有效去除，導致合格終產品的得率在10％-50％之間。

在同一篇文章中提到細胞培養過程中添加蛋白酶抑制劑(鹽酸苯甲脒)控制降解，但對產品的成藥還是增加了風險，在后續的工藝中要對蛋白酶抑制劑進行滅活及根除也會使得整個產品的制備工藝更加復雜和不經濟，而且添加蛋白酶抑制劑只能降低GLP-1-Fc分子N-端降解的程度，不能有效抑制其發生，不能真正解決降解問題。另一種去除GLP-1-Fc分子N-端降解產物的方法是使用多種色譜柱層析進行多步驟的純化，雖然也能得到非常純的GLP-1-Fc融合蛋白，但是全過程的產率大大下降至20％以下，大大低于治療性抗體藥物大于70％的得率水平。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的制備方法，用于解決現有技術中的問題。本發明發明人將GLP-1-Fc表達質粒DNA導入不同的哺乳動物細胞系中，驚奇的發現在CHO細胞系DXB11中所表達的GLP-1-Fc融合蛋白無降解出現，以至于合格終產品的得率大于70％。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種GLP-1或其類似物與抗體Fc片段融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：