[發明專利]高黑芥子酶活性益生菌菌株保藏方法

在審

• 申請號: 201410530160.7
• 申請日: 2014-10-10
• 公開（公告）號: CN104293669A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 單毓娟;張蘭威;李寶龍;任明華;宋微;雷鵬;何燦霞;田思聰
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12R1/23;C12R1/245;C12R1/25;C12R1/225;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱龍科專利代理有限公司 23206
• 代理人: 高媛

技術領域

本發明涉及一種益生菌保藏方法。

背景技術

益生菌通常被定義為一類對宿主健康有益的活性微生物。一般認為其主要包括三大類：第一大類乳酸桿菌類，常見的有嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、酪乳桿菌、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌；第二大類雙歧桿菌類，有長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌，此外卵形雙歧桿菌和短雙歧桿菌也都是比較常見的；第三大類革蘭氏陽性球菌類，主要包括糞鏈球菌、乳酸乳球菌等。另外，不少學者把酵母菌也歸為是益生菌的一種。

顧名思義益生菌就是對人體有很強的益生功效的一類細菌。其具體表現在以下幾個方面：益生菌可以有效地調節人體腸道，并對腹瀉起到一定的預防作用。如果能及時補充益生菌就可使人體腸道中的該益生菌成為優勢菌種，從而對致病菌的生長形成抑制作用，這樣便有助于保持人體腸道的正常功能；益生菌有助于緩解過敏癥狀。過敏是由于人體的免疫系統過于敏感誤把正常物質當成有害物質造成的，常見的有花粉過敏、過敏性皮炎和哮喘等。一般認為益生菌抗過敏機制為抑制Th2細胞活性，提高Th1細胞活性使兩者達到動態平衡來達到緩解過敏癥狀的目的。對于嬰幼兒來說，這是一個福音。嬰幼兒發生過敏反應時，考慮到其年齡較小及正處于最重要的發育期，傳統的藥物治療過敏由于不可避免的副作用必須認真考慮，而益生菌由于是人體腸道的有機組成部分故而是抗過敏的有效手段。不僅如此，益生菌還可以以酸奶、乳飲料等多種載體的形式進入嬰幼兒體內，可接受性強；益生菌有助于有效緩解乳糖不耐癥，益生菌可分泌β—半乳糖苷酶，可將乳糖分解為乳酸，從而有效改善乳糖不耐癥。除此之外，益生菌還能降低人體膽固醇、預防肥胖、預防腫瘤、增強人體免疫功能，對于高血壓也有一定的緩解功效。

實驗室常用的益生菌保藏方法有：斜面劃線法、液體石蠟覆蓋法、甘油低溫冷凍法和冷凍干燥保藏法。四種保藏方法各有優缺點，斜面劃線法最為簡單，將需要保存的益生菌劃線接種到MRS固體斜面上，待菌株充分生長后，放入4℃冰箱中即可。該方法雖較簡單，實驗室也經常用得到，但該方法的缺點就是保藏期較短，一般只有1-2個月，且保藏的益生菌容易被污染；液體石蠟覆蓋法的保存期較長，可以達到1-2年。此方法的操作相對而言也算比較簡單，但要注意隨時豎直放置，以使液體石蠟隨時保持對菌體的覆蓋；甘油低溫冷凍法的保藏時間較長且不易產生變異，菌株損失率低，是實驗室經常選用的方法；冷凍干燥保藏法，較為復雜，對實驗設備要求較高，但是具有保存時間較的優點長，最長可達數十年，因此被譽為最有效的保藏方法。??

發明內容

本發明的目的是提供一種甘油低溫冷凍保藏高黑芥子酶活性益生菌菌株的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種甘油低溫冷凍保藏高黑芥子酶活性益生菌菌株的方法，其具體實施步驟如下：

將高黑芥子酶活性益生菌菌株以2-5%接種量接種到50-100mL?MRS液體培養基中37℃擴大培養24-48h，以使細菌生長進入穩定期，無菌的30-40%甘油與菌懸液(60-70%)各1mL加入滅菌的容量為3mL的離心管，塑料封口膜密封后放入-20℃冰箱保存0.5-1h后，立即放入冷凍罐（裝有90vol.%異丙醇+10vol.%酒精）中，使溫度均勻下降（24h內），然后放入液氮罐中保存。

本發明中，所述高黑芥子酶活性益生菌的篩選方法如下：

一、將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養基中，于37℃恒溫培養24h，如此反復活化2-3次即可使菌株恢復活力。

本步驟中，所述益生菌為桿菌類益生菌（乳桿菌和雙歧桿菌）。

本步驟中，所述改良MRS液體培養基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物?10g、酵母提取物?5.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸鈉2.0g、磷酸氫二鉀?2.0g、七水硫酸鎂?0.2g、七水硫酸錳?0.05g，溶于水，然后加1ml?吐溫?80，用水調至1000ml。

二、初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液5mL培養待篩菌株，培養時間48h，培養溫度30℃，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用于下一步實驗。

本步驟中，所述含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養液的配制方法如下：無菌100mmol/L黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養基以1:20?的體積比混合。