[發明專利]老芒麥幼穗離體培養再生植株的方法

有效

• 申請號: 201410528793.4
• 申請日: 2014-10-08
• 公開（公告）號: CN104304009A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 劉志鵬;王宇;馬利超;謝文剛;王彥榮
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N59/26;A01P21/00
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

技術領域

本發明涉及一種以老芒麥幼穗為外植體進行組織培養，獲得再生植株的方法，屬于農業栽培中通過組織培養技術的植物再生領域。

背景技術

老芒麥(Elymus?sibiricus)又名垂穗大麥草、西伯利亞披堿草，是禾本科披堿草屬多年生草本疏叢型植物，在我國的東北、華北、西北和青藏高原等地區廣泛分布，是草甸草原和草甸群落中的優勢種和建群種(周永紅等，1999；陳默君和賈慎修，2002)。因其分蘗力強，抗寒、抗旱性好，并且產草量高，是被廣泛栽培的優良牧草。此外，老芒麥可以建立單一的人工割草地和放牧地，也可以與其它禾草和豆科牧草混播建立優質、高產的人工草地；植株葉量豐富，營養枝多，穗狀花序開放比較集中，結實率高，種子產量和產草量在第二年達到最高峰(王比德，1986；馬宗仁和郭博，1991；吳勤，1992；武保國，2003)。肖波等(2010)通過對老芒麥的培肥效應進行研究，發現其為人們帶來經濟、生態效益的同時，可改善表層土壤的理化性質，并且在荒地土壤的科學培育中發揮著重要作用。

組織培養是指在無菌條件下利用人工培養基對植物組織進行培養，是生物工程研究的基礎，是進行遺傳轉化和植物改良研究的基本環節。李達旭等(2006)建立了川草二號老芒麥成熟種子、下胚軸和幼葉的完整植株再生體系；Lee等(2012)利用西伯利亞老芒麥成熟種子誘導愈傷及分化形成再生植株。然而到目前為止，以老芒麥幼穗為外植體進行組織培養的研究還鮮有報道，因此建立以老芒麥幼穗為外植體的組織培養再生體系很有必要，同時也為今后的轉基因研究奠定了基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題和提出的技術任務是克服現有老芒麥離體培養技術產生的污染率高、愈傷誘導率低和再生性差等缺陷，提供一種老芒麥幼穗離體培養植株再生方法，以通過選用老芒麥的幼穗作為外植體材料，調控外源植物激素和培養基的滲透壓，獲得高比例的顆粒狀胚性愈傷組織，建立植株再生的技術體系，為進行遺傳轉化和性狀改良提供研究平臺。

本發明采用以下技術方案：一種老芒麥幼穗離體培養再生植株的方法，其主要特點在于包括以下步驟：

1)外植體的獲取：取處于雌雄蕊分化期、長度為3.0-10cm的老芒麥幼穗，剪取植株上半部，去掉外層的葉片后在無菌條件下用棉球蘸取70％乙醇擦拭其莖稈和葉鞘，用消過毒的鑷子剝取幼穗，將其切成2-3mm的小段；

2)愈傷組織誘導：將外植體接種于愈傷誘導培養基上，每皿接種10個幼穗小段，放入培養室培養，培養室溫度為24-26℃，光照時間16h/d，黑暗時間8h/d，培養時間為1-2個月；

3)將誘導的愈傷組織接種于繼代培養基中進行培養，培養室溫度為24-26℃，光照時間16h/d，黑暗時間8h/d，培養天數為20-30d；

4)將步驟3)的老芒麥愈傷組織轉移至分化培養基中培養，培養室溫度為24-26℃，光照時間16h/d，黑暗時間8h/d，培養天數為20-30d；

5)待步驟4)的老芒麥愈傷組織有綠芽長出，將其轉移至生根成苗培養基上進行培養，培養室溫度為24-26℃，光照時間16h/d，黑暗時間8h/d；

6)待有5條以上健壯根長出，將三角瓶上的封口膜去掉，同時加入5mL的蒸餾水，煉苗3d，然后將小植株從三角瓶中取出，洗凈根部的培養基，最后移栽于混有草炭土和蛭石比例為1:1的花盆中，最初3d給幼苗遮上塑料薄膜以保持濕度。

所述的老芒麥幼穗離體培養再生植株的方法，所述的愈傷組織誘導培養基為：硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，七水合硫酸鎂370mg/L，二水合氯化鈣440mg/L，磷酸二氫鉀170mg/L，四水合硫酸錳22.3mg/L，七水合硫酸鋅8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化鉀0.83mg/L，二水合鉬酸鈉0.25mg/L，五水合硫酸銅0.025mg/L，六水合氯化鈷0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.1mg/L，煙酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，七水合硫酸亞鐵27.8mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，2,4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L。