[發明專利]一種基于TALEN介導的Sp110巨噬細胞特異打靶載體及重組細胞

有效

• 申請號: 201410528091.6
• 申請日: 2014-10-09
• 公開（公告）號: CN104293833B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 張涌;吳海波;王勇勝;張艷;呂佳星
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/873
• 代理公司: 陜西增瑞律師事務所61219
• 代理人: 孫衛增

技術領域

本發明屬于轉基因克隆動物技術領域，涉及一種基于TALEN介導的Sp110巨噬細胞特異打靶載體及重組細胞。

背景技術

牛結核病是由牛分支桿菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)和結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)等結核分支桿菌復合群引起的一種慢性消耗性傳染疾病，其主要表現為牛生產力明顯下降、乳房炎和結核性胸膜炎等癥狀。牛結核的傳播和流行嚴重影響了地區農業經濟的發展，特別是對動物及動物產品的國際貿易有著重大的影響(Biet et al.,2005)。

SP110核體蛋白基因(SP110nuclear body protein)是新近發現的介導結核分枝桿菌天然免疫的一個基因，該基因能夠限制結核分枝桿菌在巨噬細胞內的繁殖，并且能調節巨噬細胞的死亡方式(Behar,2011)。SP110基因的發現為預防牛結核病的流行和傳播提供了一種新思路。

TALEN(Transcription Activator-Like Effector nucleases)是由植物致病細菌Xanthomonas分泌的一類具有轉錄激活功能的蛋白。由于TALE的DNA結合域中的重復氨基酸序列模塊可以與單堿基發生特異性結合，因此理論上可以任意選擇靶DNA序列進行改造，是一種非常有效的基因組改造工具酶。TALENs由于具有一些比鋅指核酸酶(ZFNs)更優越的特點，現在成為了科研人員用于研究基因功能和潛在基因治療應用的重要工具。應用TALEN介導的基因組修飾已成功應用于多種模式動物，如果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠等。

轉基因動物在家畜品種改良方面具有巨大的應用潛力。在實際生產中，轉基因技術可以改善動物肉質，提高增長率、飼料利用率，改善乳質及其成分，改良繁殖性能等(Niemann et al.,2005)。通過轉基因技術，提高動物自身對結核分支桿菌的抵抗力將是今后控制牛結核病的重要思路。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種基于TALEN介導的Sp110巨噬細胞特異打靶載體及重組細胞，在牛28號染色體M-S位點定點整合SP110基因構建牛胎兒成纖維細胞系，以該細胞系作為核供體細胞，為研制抗結核病的轉基因牛提供堅實的基礎。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種基于TALEN介導的Sp110巨噬細胞特異打靶載體，包括TALEN真核表達載體和打靶載體；

所述的TALEN真核表達載體包括TALEN左臂表達載體和TALEN右臂臂表達載體，分別識別TALEN靶點的上游和下游識別位點，TALEN靶點位于牛基因組28號染色體SFTPA1和MAT1A基因的基因間序列；

所述的打靶載體上克隆有重組基因MSR1-Sp110-PolyA，并克隆有作為同源臂的TALEN靶點上游和下游的同源序列；

所述的重組基因MSR1-Sp110-PolyA是在Sp110基因的上游連接牛巨噬細胞特異性啟動子MSR1，在下游連接PolyA。

所述的TALEN左臂表達載體上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述的TALEN右臂表達載體上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述還在TALEN左臂/TALEN右臂的下游連接T2A間隔、熒光標簽GFP和mCherry。

所述的重組基因MSR1-SP110-PloyA中，SP110的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，MSR1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的同源臂包括分別位于重組基因MSR1-SP110-PloyA上游、下游的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂與MSR1-SP110-PloyA之間還設有一對同向的Loxp，Loxp之間設有第一篩選基因，下游同源臂的下游還設有第二篩選基因。

所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

所述的TALEN真核表達載體為pCS2-TALEN，其TALEN左臂表達載體和TALEN右臂表達載體，分別通過在pCS2-Fok I載體上連接TALEN左臂、TALEN右臂而構建；