[發(fā)明專(zhuān)利]用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A001

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410525014.5
• 申請(qǐng)日: 2014-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104293942A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃宏文;張瓊;鐘彩虹;龔俊杰;劉春燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院武漢植物園
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A001（A001是為區(qū)別其它SSR分子標(biāo)記而命名的，A為獼猴桃拉丁名Actinidia的首字母），即用于獼猴桃幼苗雌雄性別性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率，減少土地和人力成本。

背景技術(shù)

獼猴桃（Actinidia?chinensis?Planch.)富含果實(shí)維生素C、膳食纖維和多種礦物營(yíng)養(yǎng)，被譽(yù)為“水果之王”，是一種有益健康的新興高檔水果。隨著人民生活水平的迅速提高，對(duì)高品質(zhì)和新品種獼猴桃的需求顯著增加，獼猴桃育種效率亟待提升。獼猴桃為功能性雌雄異株植物，具有花形態(tài)相似但雌雄器官相異的雌花和雄花。獼猴桃雜交后代的雌雄分離比例約為1：1，鑒于獼猴桃雌雄異株的性別功能，獼猴桃果園通常配置少量授粉雄株以保證果園產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，剩余的雄株則除掉。作為多年生果樹(shù)，獼猴桃在傳統(tǒng)育種中面臨著童期長(zhǎng)、占地面積大等問(wèn)題。獼猴桃幼苗往往下地種植數(shù)年后才能開(kāi)花，利用獼猴桃花形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異方能鑒別植株的雌雄性別，因此在開(kāi)花前的數(shù)年內(nèi)大量的不結(jié)果雄株給育種工作造成了極大的浪費(fèi)。由于缺乏可用的獼猴桃雌雄性別鑒別的分子標(biāo)記，獼猴桃植株的早期性別鑒定工作一直難以開(kāi)展。SSR標(biāo)記具高多態(tài)性、位點(diǎn)特異性、穩(wěn)定性高和操作程序簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，是一種檢測(cè)方便的共顯性遺傳標(biāo)記。結(jié)合遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究成果，開(kāi)展獼猴桃分子標(biāo)記輔助育種研究，構(gòu)建經(jīng)濟(jì)、高效的分子育種技術(shù)體系，已經(jīng)成為獼猴桃育種的重要研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A001。

具體要求是：

篩選出用于獼猴桃早期性別鑒定的分子標(biāo)記；

提供上述分子標(biāo)記的獲得方法；

提供上述分子標(biāo)記在獼猴桃性別鑒定以及標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

利用獼猴桃高密度遺傳圖譜，定位花性別表型性狀位點(diǎn)，在性別決定區(qū)間篩選SSR標(biāo)記，最終得到能用于獼猴桃早期性別鑒定的分子標(biāo)記，形成本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)方案。獼猴桃植株早期性別鑒定在很大程度減少育種前期在土地、生產(chǎn)資料和人力成本的浪費(fèi)，有著重要的理論學(xué)術(shù)意義和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

一、分子標(biāo)記A001

用于獼猴桃雜交群體雌雄性別鑒定的SSR分子標(biāo)記A001（簡(jiǎn)稱(chēng)分子標(biāo)記A001）在雌株中擴(kuò)增得到的特異片段核苷酸序列如SEQ.ID?No1?所示。

分子標(biāo)記是基于獼猴桃性別決定區(qū)域的簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性開(kāi)發(fā)的。根據(jù)性別相關(guān)區(qū)域的序列信息設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為雌株為兩條譜帶，而雄株為一條譜帶，通過(guò)擴(kuò)增長(zhǎng)度為202bp的雌株特異片段來(lái)區(qū)分獼猴桃雌雄性別。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的引物。

所述S001標(biāo)記的引物序列如SEQ.ID?No2?和?SEQ.ID?No3?所示。

二、分子標(biāo)記獲得方法

分子標(biāo)記獲得方法包括下列步驟：

①構(gòu)建獼猴桃高密度遺傳圖譜；

②收集性別表型轉(zhuǎn)換為表型標(biāo)記；

③在遺傳圖譜上定位表型標(biāo)記；

④在基因組序列上確定性別決定區(qū)間；

⑤篩選性別決定區(qū)間內(nèi)SSR標(biāo)記。

其工作機(jī)理是：

基因組中存在許多簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）單元，其數(shù)目存在高度變異。由于特定的SSR的側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，因而可以根據(jù)側(cè)翼序列合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而將單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)。由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物就產(chǎn)生長(zhǎng)度的多態(tài)性，以此來(lái)檢測(cè)等位基因的多態(tài)性。

三、分子標(biāo)記應(yīng)用

分子標(biāo)記A001在山梨獼猴桃和中華獼猴桃‘桂海4號(hào)’雜交群體中的應(yīng)用

利用上述分子標(biāo)記的引物擴(kuò)增獼猴桃雜交群體中雌株基因組DNA和雄株基因組DNA，在獼猴桃雌株中擴(kuò)增得到兩條譜帶，其中一條譜帶為雌株特有的分子標(biāo)記特征譜帶，所述攜帶目標(biāo)特征譜帶的植株鑒定為雌株。

在分子標(biāo)記引物擴(kuò)增獼猴桃基因組DNA中，PCR?反應(yīng)擴(kuò)增體系為：

10μL反應(yīng)體系包括正、反向引物各0.2μM，0.2mM?dNTPs，2mM?MgCl₂，1μl?10X?Taq?buffer，0.5?units?Taq?聚合酶，50ng?DNA?模板。