[發(fā)明專利]一種檢測(cè)活性污泥中革蘭氏陰性菌相對(duì)含量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410522929.0
• 申請(qǐng)日: 2014-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN104215620A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任洪強(qiáng);蘇文博;丁麗麗;耿金菊;許柯;張宴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 蔣海軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)污泥工作性能的方法，具體而言是檢測(cè)活性污泥中革蘭氏陰性菌相對(duì)含量。

背景技術(shù)

活性污泥法在處理城市和工業(yè)廢水中有著廣泛的應(yīng)用。污水生物處理效率及其控制是由微生物的數(shù)量和質(zhì)量決定的。微生物量與污水特征和去除效率緊密相關(guān)。活性污泥中的生物量由混合液懸浮固體濃度(MLSS)、混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度(MLVSS)表示。但是MLSS和MLVSS不僅僅包含活性微生物，還包括所有的顆粒物質(zhì)和細(xì)胞碎片。因此上述兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)并不能很好地代表有活性的微生物量。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)PCR技術(shù)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以對(duì)活性污泥進(jìn)行分析，得到活性污泥中各微生物的含量。PCR法在該領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，但是它們也存在許多的不足之處：①每次DNA的提取效率不同，從而導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差；②原核生物細(xì)胞裂解的程度不同，結(jié)果不易裂解細(xì)胞的豐度估計(jì)偏低；③引物對(duì)不同樣品的擴(kuò)增效率又差異，故會(huì)帶來群落豐度估計(jì)偏差。

細(xì)菌是活性污泥的組成和凈化功能中心，是活性污泥有機(jī)相的最主要成分。1993年Wagner等利用熒光探針特異性地與活性污泥菌膠團(tuán)雜交，然后利用EM觀察技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品B1和B2中α-、β-和γ-變形菌類群含量分別為：10％、42％和34％，37％、37％、和7％；這三個(gè)類群的總含量均超過了活性污泥總細(xì)胞的80％，因此，他們認(rèn)為活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群是α-、β-和γ-變形菌。后來Wagner等又利用LSCM掃描直觀清晰地描述了這個(gè)結(jié)果。

由于活性污泥中優(yōu)勢(shì)菌為α-、β-和γ-變形菌，而變形菌門全部屬于革蘭氏陰性菌，因此檢測(cè)活性污泥樣品中革蘭氏陰性菌的相對(duì)含量，對(duì)于評(píng)價(jià)污泥活性、了解部分微生物群落結(jié)構(gòu)，有著極其重要的意義。

脂多糖又名內(nèi)毒素，是一種嵌入在革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中復(fù)雜的糖脂，是革蘭氏陰性菌所特有。因此，通過檢測(cè)革蘭氏陰性菌特有的脂多糖(或內(nèi)毒素)，理論上可以推導(dǎo)出革蘭氏陰性菌的相對(duì)量。每個(gè)細(xì)胞含有超過200萬個(gè)LPS分子。LPS的分子結(jié)構(gòu)可以分為3個(gè)區(qū)域：O-特異性多糖鏈(也稱O-抗原)、核心多糖和類脂A(Lipid?A)。核心多糖區(qū)分為外核區(qū)與內(nèi)核區(qū)，離類脂A遠(yuǎn)的外核區(qū)是經(jīng)常出現(xiàn)的糖，如葡萄糖、乳糖和乙酰葡糖胺。目前中國藥典規(guī)定的內(nèi)毒素檢測(cè)方法是鱟試劑法。美洲鱟(LAL)和東方鱟(TAL)兩種用于生產(chǎn)鱟試劑。但是LAL/TAL試驗(yàn)屬于生物毒性測(cè)試方法，不是精確的分析方法，一些非內(nèi)毒素分子如Beta-葡聚糖也能引起相似的凝集現(xiàn)象。LAL/TAL試劑為鱟血的提取物，屬于生物試劑，樣品中化學(xué)物質(zhì)蛋白和其他試劑容易對(duì)其產(chǎn)生影響。與藥典規(guī)定的藥品和醫(yī)療器械相比活性污泥樣品成分復(fù)雜，干擾因素明顯。因此LAL/TAL不適合污泥樣品中內(nèi)毒素的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題

現(xiàn)有技術(shù)不能檢測(cè)活性污泥中革蘭氏陰性菌相對(duì)含量，為了快速檢測(cè)活性污泥中優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)含量，更準(zhǔn)確了解污泥活性以及群落的相對(duì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)活性污泥中革蘭氏陰性菌相對(duì)含量的分析方法，能準(zhǔn)確、定量分析。

2、技術(shù)方案

發(fā)明原理：核心多糖區(qū)分為外核區(qū)與內(nèi)核區(qū)，臨近類脂A的內(nèi)核區(qū)由庚糖、2-酮基，3-脫氧辛酸(KDO)組成。內(nèi)核區(qū)中的2-酮基3-脫氧辛酸為活性污泥中LPS分子所特有，且每個(gè)LPS分子包含2個(gè)KDO分子。因此，通過檢測(cè)特異性的KDO分子的含量，從理論上可以推導(dǎo)出陰性菌的相對(duì)量。檢測(cè)KDO技術(shù)屬于理化檢測(cè)，較生物測(cè)試方法更準(zhǔn)確。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案具體步驟如下：

一種檢測(cè)活性污泥中革蘭氏陰性菌相對(duì)含量的方法，其步驟為：

步驟一，高壓均質(zhì)破碎活性污泥中菌膠團(tuán)；

步驟二，酸性條件下從游離細(xì)菌及細(xì)胞碎片中分離KDO(2-酮基-3-脫氧辛酸)；

步驟三，對(duì)分離出的KDO進(jìn)行熒光標(biāo)記，得到熒光衍生產(chǎn)物，避光保存；

步驟四，衍生后產(chǎn)物通過高效液相色譜進(jìn)行分離并用熒光進(jìn)行定量檢測(cè)，根據(jù)所得結(jié)果獲得活性污泥中革蘭氏陰性菌相對(duì)含量的信息。

所述破碎污泥中的菌膠團(tuán)，是通過高壓均質(zhì)破碎，將污泥中團(tuán)聚的細(xì)菌打碎，打碎成游離的細(xì)菌或?qū)⒄麄€(gè)細(xì)胞破碎為細(xì)胞碎片。從而減輕后續(xù)解離KDO步驟的壓力，縮短反應(yīng)時(shí)間。

所述從游離細(xì)菌或細(xì)胞碎片中分離KDO，是加入強(qiáng)酸至破碎后的污泥，并加熱。從而將固著在細(xì)胞膜上的LPS解離出來，形成游離型LPS，并進(jìn)一步將LPS中的KDO分子全部解離出來，使得后續(xù)的化學(xué)衍生反應(yīng)完全，熒光定量準(zhǔn)確。