[發(fā)明專利]構(gòu)建測序文庫的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410521656.8
• 申請(qǐng)日: 2014-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN104293941B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂小星;錢朝陽;管彥芳;常連鵬;易鑫;朱紅梅;楊玲;吳仁花
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津華大基因科技有限公司;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12M1/34;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及構(gòu)建測序文庫的方法、測序方法、確定核酸序列的方法、構(gòu)建測序文庫的裝置、測序設(shè)備以及確定核酸序列的系統(tǒng)。

背景技術(shù)

高通量測序日益被關(guān)注，但是目前高通量測序用于低頻率突變的檢測仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出了用于構(gòu)建測序文庫的方法以及檢測低頻率突變的手段。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建測序文庫的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：(a)在雙鏈DNA片段的兩端分別連接接頭，以便獲得連接產(chǎn)物，其中，所述接頭包括第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈部分匹配并且所述第一鏈包含第一標(biāo)簽序列，以便所述接頭上限定出雙鏈區(qū)和兩個(gè)單鏈尾部，所述兩個(gè)單鏈尾部之一的序列中包含第一標(biāo)簽；(b)將所述連接產(chǎn)物裂解為單鏈DNA片段；(c)利用探針對(duì)所述單鏈DNA片段進(jìn)行篩選，其中，所述探針特異性識(shí)別預(yù)定區(qū)域，其中，所述預(yù)定區(qū)域包括下列之一：(1)表1所示基因的至少之一；(2)(1)的CDS區(qū)域；以及(3)(2)的上下游至少10bp的區(qū)域；(d)利用第一引物對(duì)所述單鏈DNA片段進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，以便獲得鏈延伸產(chǎn)物，其中，所述第一引物包括第二標(biāo)簽序列，并且所述第一引物適于與所述接頭的第一鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，只是所述第一標(biāo)簽序列與所述第二標(biāo)簽序列之間存在錯(cuò)配；(e)對(duì)所述鏈延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成所述測序文庫，其中，所述擴(kuò)增采用適于同時(shí)擴(kuò)增所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列的引物。。

由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的構(gòu)建測序文庫的方法，能夠有效地構(gòu)建測序文庫，同時(shí)，所構(gòu)建的測序文庫中，針對(duì)相同的雙鏈DNA片段(在本文中也被稱為“源序列”)的每條鏈，分別獲得了具有第一標(biāo)簽序列和第二標(biāo)簽序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，由此，在后續(xù)測序結(jié)果的分析中，可以依據(jù)兩種標(biāo)簽的測序結(jié)果進(jìn)行互相校正，提高分析結(jié)果的可靠性。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述雙鏈DNA片段是通過下列步驟獲得的：將核酸樣本進(jìn)行末端修復(fù)，以便獲得經(jīng)過修復(fù)的核酸樣本；以及在所述核酸樣本的5’末端添加堿基A，以便獲得兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本，所述兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本構(gòu)成所述雙鏈DNA片段。由此，可以在后續(xù)操作中，方便地在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭。從而，提高了構(gòu)建測序文庫的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸樣本為人基因組DNA的至少一部分或游離核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述人游離核酸是從患者的外周血提取的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述患者患有肺癌。由此，利用本發(fā)明實(shí)施例的方法，能夠有效地對(duì)人肺癌病患者的基因突變進(jìn)行有效的分析，進(jìn)而能夠有效用于肺癌的早診、個(gè)體化用藥、以及術(shù)后監(jiān)控等。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述人基因組DNA的至少一部分是通過對(duì)人基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)打斷而獲得的。由此，可以在后續(xù)操作中，方便地在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭。從而提高了構(gòu)建測序文庫的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述接頭具有3’堿基T粘性末端。由此，可以在后續(xù)操作中，方便地在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭。從而，提高了構(gòu)建測序文庫的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述單鏈DNA片段是通過將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行變性處理獲得的。由此，可以快速有效的獲得單鏈DNA片段。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述變性處理可以為熱變性處理或堿變性處理。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述探針是以芯片的形式提供的。由此，可以提高探針篩選的效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在存在UDG酶/FPG酶時(shí)，進(jìn)行所述鏈延伸反應(yīng)。由此，可以有效地對(duì)存在損傷的DNA在鏈延伸過程中進(jìn)行修復(fù)，減少假陽性的產(chǎn)生，提高構(gòu)建測序文庫的質(zhì)量。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列分別獨(dú)立地長度為4～10nt。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列的長度均為8nt。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一標(biāo)簽序列和所述第二標(biāo)簽序列之間存在至少2nt的錯(cuò)配。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，采用如此設(shè)置，能夠有效地提高在后續(xù)分析中，利用第一標(biāo)簽序列和第二標(biāo)簽序列進(jìn)行校正的效率。