[發(fā)明專利]抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因及其生產(chǎn)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410521516.0
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104313028A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李相魯;張嚴(yán)冬;孟建軍;梁莊嚴(yán)
• 申請（專利權(quán)）人: 北京生科東方科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/47;C12N15/70;C12P21/02
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 孫詩雨;張真真

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽的重組發(fā)酵生產(chǎn)，以及純化方法。

背景技術(shù)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性反復(fù)發(fā)作的以全身關(guān)節(jié)炎癥改變?yōu)橹鞯奶弁葱约膊。⑽拿QRheumatoid?arthritis，簡寫RA，是一種常見病、多發(fā)病。發(fā)病時間可以持續(xù)幾天、幾周或幾個月，并帶有不同程度的活動性，嚴(yán)重者病人生活不能自理，往往累及終生，形成長期病痛，極大地危害著人類的生命和健康，人們期望能研發(fā)和生產(chǎn)出更多高效優(yōu)質(zhì)的藥物在臨床應(yīng)用。

現(xiàn)在應(yīng)用的RA治療藥物有抗炎藥，如阿司匹林、皮質(zhì)類固醇和通過抑制或消滅機(jī)體免疫反應(yīng)而減輕疾病癥狀的藥物，這些藥物雖可改善癥狀，但不能去除風(fēng)濕的基本病理改變，而且還存在減弱機(jī)體的抗病能力的危害。

DNAJP1是一個通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)開發(fā)的新藥多肽，它起源于熱休克蛋白dnaJ.，在該蛋白的基礎(chǔ)上通過合成法得到的。熱休克蛋白細(xì)胞在經(jīng)受諸如發(fā)炎、自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下會產(chǎn)生熱休克蛋白。dnaJP1的作用機(jī)制在于通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能來減少發(fā)炎、增強(qiáng)調(diào)控免疫系統(tǒng)，使得由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的炎癥反應(yīng)受到抑制，美國160例二期臨床實(shí)驗(yàn)表明，口服該多肽可以降低炎癥反應(yīng)，取得了良好的效果。

抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽dnaJP1與傳統(tǒng)的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎物相比，具有無可比擬的優(yōu)勢。該藥物不會對患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，通過口服應(yīng)用dnaJP1，因?yàn)槟c內(nèi)的粘膜免疫系統(tǒng)可以對患者的免疫系統(tǒng)進(jìn)行重新馴化，從而有效改善免疫系統(tǒng)。通過模擬反應(yīng)，幫助患者免疫系統(tǒng)重新識別自身物質(zhì)和外源抗原，保護(hù)原來深受破壞的病灶得以恢復(fù)，癥狀得到緩解，通過使得患者的免疫系統(tǒng)耐受dnaJ而起到治療作用，具有安全性高、作用直接迅速、易被人體吸收、特異性高、持續(xù)時間長、可口服等優(yōu)點(diǎn)，具有極為誘人的廣闊前景。

現(xiàn)有的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽dnaJP1的純化方法為化學(xué)合成法。美國發(fā)明專利US5773570A，該技術(shù)利用聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）從業(yè)和重組的噬菌體質(zhì)粒包含dnaK和dnaJ中擴(kuò)增了含有dnaJ基因的片段，然后將該片段亞克隆到PCG808fX的Xba1位點(diǎn)，作為麥芽糖結(jié)合融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，然后用含有針對該融合蛋白的兔抗血清將用pUC19質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)的rdnaJ進(jìn)行純化，最后，用固定化的蛋白A，將IgG-MBL-DnaJ進(jìn)行純化，然后用pH2.5的甘氨酸緩沖液進(jìn)行洗脫出來，SDS電泳結(jié)果表明只有一條帶，融合蛋白符合預(yù)期，分子量在41KD。該專利采用了融合蛋白和目的多肽融合生產(chǎn)的方法，融合標(biāo)簽本身的分子量為40KD，而目的多肽的分子量僅有1.76KD，相差20多倍，也就是說即使產(chǎn)生大量的融合蛋白，其實(shí)含有目的蛋白的產(chǎn)量很低(占總蛋白含量的4%)，造成不必要的浪費(fèi)，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。另外他純化出來的是融合蛋白（41KD），而不是真正的dnaJP1多肽(1.76KD)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽dnaJP1是由幾個氨基酸組成的短肽，而要實(shí)現(xiàn)短肽直接在宿主菌中的表達(dá)并分離出來非常困難，而采取融合表達(dá)方式也因采用較大的融合標(biāo)簽和較低的抗炎基因拷貝導(dǎo)致表達(dá)量很低。本發(fā)明構(gòu)建具有合適高拷貝數(shù)的基因，通過將其基因進(jìn)行6個重復(fù)串聯(lián)的方法來增加產(chǎn)量，并采用較小的融合標(biāo)簽來融合表達(dá)該基因已增加在表達(dá)產(chǎn)物中的相對比重，對實(shí)現(xiàn)抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小肽的高效表達(dá)，相對比重約為50%，由于生成的融合蛋白是包涵體，所以非常容易純化，純化后的包涵體蛋白，采用溴化氰裂解，專一性強(qiáng)，成本低，本發(fā)明采用高壓裂解的方法清除溴化氰，成本低，污染小，操作簡單，易于產(chǎn)業(yè)化。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

所述的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，核苷酸序列所編碼的多肽如SEQ?ID?NO：2所示。

所述的表達(dá)抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因的多肽串聯(lián)生產(chǎn)方法，利用大腸桿菌的pET31b(+)表達(dá)體系，將SEQ?ID?NO：1基因序列亞克隆到質(zhì)粒pET31b(+)融合標(biāo)簽KSI的基因序列的后面，限制性內(nèi)切酶為AwnI，然后將亞克隆得到的轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3）plysS中進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，得到的菌體通過低溫高壓裂解得到包涵體，洗滌后的包涵體利用溴化氰(CNBr)或者蛋氨酸裂解酶進(jìn)行裂解成單個多肽，裂解完畢后加堿水猝滅反應(yīng)，采用高溫高壓水解法，除去溴化氰等雜質(zhì)，通過納濾除鹽，得到純品。