[發(fā)明專利]一種長效內皮抑素融合蛋白的制備方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410521467.0
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN105440138A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設計）人: 馮美卿;韓磊;王寶龍;王鑫;鞠佃文;葉麗
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81;A61K38/39;A61K38/24;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發(fā)明屬生物技術領域，涉及長效融合蛋白藥物，具體涉及一種長效內皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白及其制備方法和用途，尤其是長效融合蛋白藥物人血管內皮抑素與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)的融合蛋白及其制備方法和用途

背景技術

現(xiàn)有技術公開了內皮抑素是人膠原蛋白18的C末端片段，由184個氨基酸殘基組成，其分子量20kDa，它是血管生成的特異性抑制劑。目前已有超過千余篇文獻報道了內皮抑素可以通過抑制血管內皮細胞的增殖及血管生成作用來抗腫瘤。在體內，內皮抑素由肝臟合成。內皮抑素在抑制血管內皮細胞的增殖及遷移方面表現(xiàn)良好，并且，在幾種腫瘤模型的研究中證實內皮抑素的使用不會存在耐藥性。目前，E.coli和酵母表達系統(tǒng)是兩種主要的重組內皮抑素生產的表達系統(tǒng)。然而，E.coli表達的重組內皮抑素蛋白折疊錯誤導致其溶解性很低，這大大限制了其在臨床上的應用；此外，重組內皮抑素臨床效果不佳，這主要是由其半衰期較短引起的；重組內皮抑素的半衰期不足1小時，因此，延長其半衰期將會改善其在臨床上的應用。融合蛋白技術是延長蛋白藥物半衰期的一種重要手段。之前的報道中，IgG的Fc區(qū)和人血清白蛋白都可以顯著延長重組內皮抑素的半衰期，通常蛋白的PEG化或融合Fc、血清白蛋白會降低蛋白活性。

近來，人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)被越來越多的用于延長蛋白藥物的半衰期。研究顯示，人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)是一段富含可糖基化氨基酸的肽段，人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)上氨基酸殘基的糖基化會形成空間上的障礙，阻礙蛋白藥物被蛋白酶降解；此外，人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)對蛋白藥物的分泌表達、與受體的結合及生物活性幾乎沒有任何影響。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的是提供一種新的長效融合蛋白藥物，具體涉及一種長效內皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白，尤其是長效融合蛋白藥物人血管內皮抑素與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)的融合蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明制得的內皮抑素在體內能延長其半衰期。

本發(fā)明的長效內皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白，包括與人內皮抑素至少85％序列同源的第一區(qū)和與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)至少85％序列同源的第二區(qū)。所述與人內皮抑素同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人內皮抑素同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，所述與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽。

本發(fā)明中，所述融合蛋白的第二區(qū)由人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)組成。

本發(fā)明中，所述融合蛋白包括去人內皮抑素氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)氨基酸序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。

本發(fā)明中，所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。

本發(fā)明提供了利用畢赤酵母表達系統(tǒng)高表達長效蛋白的制備方法，該方法中，主要通過基因工程技術構建人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)與人血管內皮抑素(Endostatin)融合基因的表達載體，轉染畢赤酵母細胞高表達生產Endo-CTP融合蛋白，然后純化、鑒定和生物學活性檢測，獲得Endo-CTP融合蛋白。

更具體的，本發(fā)明的制備人血管內皮抑素與人絨毛膜促性腺激素β亞單位(CTP)的融合蛋白的方法，其特征在于，其包括構建畢赤酵母表達系統(tǒng)以及表達與純化融合蛋白；該方法中利用全基因合成技術合成人內皮抑素基因片段；以及利用全基因合成技術合成人絨毛膜促性腺激素β亞單位基因片段，中間不加入任何連接肽將兩者連接，將基因片段插入到pPIC9k載體上并轉入到宿主表達系統(tǒng)中進行表達。

所述的方法中，宿主表達系統(tǒng)是酵母、昆蟲細胞，哺乳動物細胞或植物細胞等真核表達系統(tǒng)，本發(fā)明的實施例中優(yōu)選的宿主表達系統(tǒng)是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是畢赤酵母GS115。

本發(fā)明的實施例中，通過下述步驟制備所述的融合蛋白：

1)構建畢赤酵母表達系統(tǒng)

Endo-CTP基因由Genescript公司合成，其基因序列為：