[發明專利]用于檢測和測定連翹苷的抗體、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201410521402.6
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN105440128A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 趙琰;屈會化;王慶國;胡文婷;任雅君;張越;孫曄;趙妍;馮會賓;李長香
• 申請（專利權）人: 北京中醫藥大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/435;C07K14/795;C07K16/16;C07K16/06;C07H17/07;C07H1/00;C09K11/06;G01N33/577;G01N33/53
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技術領域

本發明涉及小分子半抗原的抗體及其制備方法與應用，特別是涉及連翹苷及其衍生物的抗體及其制備方法與應用。

背景技術

本發明涉及用于檢測和定量連翹苷的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶聯物(conjugate)和抗體。

其中“檢測”是指定性分析物質是否存在。

其中“測定”是指對物質進行定量分析。

連翹苷，來源于木犀科植物連翹的干燥果實的提取物。

分子式：C₂₇H₃₄O₁₁分子量：534.56

連翹苷屬于雙環氧木脂素類化合物的葡萄糖苷，熔點184℃～185℃。

研究表明，連翹苷顯示多種生物學活性和藥理作用。具有具有抗炎解熱，抗氧化，降血脂，保肝及神經保護等多種藥理活性。

目前建立了多種連翹苷的定性與定量檢測和測定分析方法，如薄層層析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含連翹苷的生物樣品(包括血漿、尿、唾液等)含有大量的影響含量測定的蛋白質及內源性物質；同時連翹苷可能呈結合狀態，必須經過處理，排除內源性雜質和代謝物的干擾，使結合狀態的連翹苷游離后才能測定；同時還需要濃縮以滿足儀器檢測靈敏度的要求，處理程序復雜，費時費力；另外由于連翹苷進入體內后，組織中的分布是極其微量的，即使經過富集，進行含量測定仍是極其困難的。最后，對于連翹苷在靶器官和組織中分布，以及細胞和亞細胞定位的研究，需要通過免疫組織化學和westblot等方法，但由于缺乏連翹苷的抗體，阻礙了此方面的研究。因此，有必要開發出一種用于檢側和測定生物樣品中連翹苷的方法，對闡明相關藥材或復方的作用機理，以及其體內分布和代謝研究，將具有特別的價值。

發明內容

本發明的半抗原連翹苷可提供確定的結構性抗原決定部位，但是它本身并不具備免疫原性，因此必須要偶聯到適宜的賦予抗原性的載體物質上，這樣所形成的免疫原才會在注射到宿主動物體內后誘發免疫應答。因此，本發明提供一種如下結構的免疫原：

其中R是0至6個碳的烷基橋(連接半抗原與載體物質的橋)，優選R＝0，即P1直接與連翹苷氧化后的醛基結合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基，更優選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞烷基。

P1是賦予抗原性的載體物質。載體物質選自蛋白質、蛋白質片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白質、蛋白質片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白，優選為牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結合球蛋白、鎖眼形血藍蛋白(keyholelimpethaemocyanin，KLH)，更優選自鎖眼形血藍蛋白或牛血清蛋白(BSA)。合成多肽或半合成多肽是具有足夠數量的可利用氨基的合成聚氨基酸，優選多聚賴氨酸。合成或天然聚合物是帶有反應官能基的聚合物材料，特別是能夠結合到半抗原產生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

半抗原的制備本發明描述了半抗原連翹苷的糖苷結構中的兩個鄰羥基經過過碘酸鈉氧化為醛基從而與載體物質發生的偶聯作用，產生免疫原。偶聯物成功制備并純化后分別經質譜(MS)和核磁共振氫譜和碳譜(1HNMR和13CNMR)確證。

免疫原的合成本發明的半抗原和蛋白質載體的連接可使用本領域己知的任何連接方式。例如過碘酸鹽氧化法等。采用過碘酸氧化法制備免疫原時，是將5毫克的半抗原連翹苷溶解在1ml20％甲醇中，加入含有8毫克的過碘酸鈉溶液1毫升，室溫下反應一個小時，緩慢滴加到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應6小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.01mol/L的CBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。

合成免疫原的分析方法為了確認載體物質上結合有適當的半抗原，在免疫前，使用紫外分光度法或矩陣輔助紫外激光解析/電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)對每個免疫原進行評估。連翹苷免疫原反應物和產物的吸收峰相比(200nm-400nm)，可判斷是否偶合，并根據反應物和產物的摩爾吸光系數計算偶聯物與半抗原的比例。

使用voyagerSTR生物分光度測量方法研究站激光解析質譜與延遲萃取結合進行MALDI-TOF質譜。將每個要分析的等分試樣在0.1％的三氟乙酸水溶液中稀釋制成1mg/ml的試樣溶液。使用芥子酸基質和牛血清白蛋白作為外標分析等分試樣(1uL)。