[發(fā)明專利]一種直觀篩選抑制黃曲霉毒素的微生物菌種的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410520947.5
• 申請(qǐng)日: 2014-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN104328161A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆培生;王凱;王琢;史翠娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12R1/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物、生物防治和真菌毒素等技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種直觀篩選抑制黃曲霉毒素的微生物菌種的方法。?

背景技術(shù)

黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，是自然界中已發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的真菌毒素，其急性毒性是劇毒化學(xué)藥品氰化鉀的10倍以上，并且，還具有強(qiáng)致癌性，免疫抑制性和致畸形性，被國際癌癥機(jī)構(gòu)列為一類致癌物質(zhì)。黃曲霉毒素可在作物收獲前和貯藏期間廣泛污染谷類作物，油料作物，豆類作物，及其加工品，對(duì)人類和動(dòng)物健康危害極大，并導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。因此，如何有效地防止黃曲霉毒素污染農(nóng)產(chǎn)品都是一個(gè)亟待解決的重大課題，以往的防治黃曲霉毒素污染食品的方法主要是用物理和化學(xué)方法清除食品中已污染的毒素或使其失去毒性，不僅成本大，而且效果也不理想，利用化學(xué)農(nóng)藥防治黃曲霉菌侵染作物和食品也曾被利用，但近年來，由于化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致的環(huán)境污染問題越來越被各國科學(xué)家和政府所重視，利用對(duì)環(huán)境友好的生物防治已成為研究熱點(diǎn)。?

生物防治黃曲霉毒素污染的關(guān)鍵是篩選出能高效抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的生防微生物菌種，由于黃曲霉毒素是極毒的真菌代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生后，肉眼又不能直接觀測(cè)到，必須借助相關(guān)儀器和分析手段才能檢測(cè)到毒素的產(chǎn)生情況，不僅手續(xù)繁瑣，而且容易造成環(huán)境污染，危害操作人員的健康，因此，建立一種直觀、快速、安全、低成本篩選能高效抑制黃曲霉毒素的微生物菌種的方法非常重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于從海洋微生物、陸地微生物、植物內(nèi)生菌等諸多不同生境來源的微生物中直觀、快速、安全、低成本篩選出能高效抑制黃曲霉毒素的微生物菌種的方法。?

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：一種直觀篩選抑制黃曲霉毒素的微生物菌種的方法，其特征包括如下步驟：

（1）所使用的黃曲霉毒素指示菌株為寄生曲霉DM菌株；

（2）所使用的篩選培養(yǎng)基為能提供海洋微生物、陸地微生物、植物內(nèi)生菌等各類微生物生長(zhǎng)的各種固體培養(yǎng)基；

（3）根據(jù)待篩選微生物種類的不同，制備適宜的固體培養(yǎng)基平板；

（4）在平板四周點(diǎn)接接種4個(gè)不同的微生物菌種，在25-35度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0-2天后，再在平板中央接種DM菌株，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天后，觀察培養(yǎng)結(jié)果；

（5）眼睛直接觀察平板中DM菌株的菌絲生長(zhǎng)和橘紅色降散盤衣酸的產(chǎn)生，凡是能抑制DM菌株菌絲中橘紅色降散盤衣酸的產(chǎn)生和/或菌絲生長(zhǎng)的微生物菌種，即是能抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的微生物菌種。

本發(fā)明與其他篩選方法顯著不同在于第一是使用寄生曲霉DM菌株為指示菌株，DM菌株具有在菌絲體中累積人眼睛可見的橘紅色的黃曲霉毒素生物合成途徑中的中間產(chǎn)物降散盤衣酸的能力，因此，可以通過眼睛直接觀察寄生曲霉DM菌株的菌絲體中是否顯示橘紅色而判斷是否有中間產(chǎn)物降散盤衣酸的產(chǎn)生，進(jìn)而進(jìn)一步判斷是否有黃曲霉毒素的產(chǎn)生，凡是能抑制橘紅色降散盤衣酸產(chǎn)生的微生物菌種，即具備抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的能力，因此，結(jié)果觀察直觀、簡(jiǎn)單、方便、快速；第二是DM菌株不產(chǎn)生黃曲霉毒素，因此，不會(huì)對(duì)環(huán)境和操作人員帶來黃曲霉毒素的危害，因此，該發(fā)明操作安全；第三是只需要人的眼睛觀察結(jié)果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備檢測(cè)即可判斷對(duì)黃曲霉毒素的抑制效果，且培養(yǎng)時(shí)間只有3-6天，具有快速、低成本的特點(diǎn)，可對(duì)大量樣品進(jìn)行篩選。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。?

實(shí)施例1：抑制黃曲霉毒素的海洋微生物菌種的篩選?

按括號(hào)內(nèi)的配方制備固體培養(yǎng)基平板（酵母提取物3?g，麥芽膏3?g，蛋白胨5?g，葡萄糖10?g，瓊脂15g，天然海水1000mL），在平板四周分別接種四個(gè)海洋微生物菌種，在25度恒溫培養(yǎng)2天后，在平板中央接種寄生曲霉DM菌株，繼續(xù)培養(yǎng)4天后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，凡是能抑制橘紅色降散盤衣酸在菌絲中產(chǎn)生的菌種，即是能抑制黃曲霉毒素合成的海洋微生物菌種，如圖1所示。

圖1是平板篩選能抑制橘紅色降散盤衣酸產(chǎn)生的海洋微生物菌種的圖。圖1中正向方的菌株為具有抑制橘紅色降散盤衣酸產(chǎn)生的海洋微生物菌種，亦即能抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的海洋微生物菌種。?

實(shí)施例2：抑制黃曲霉毒素的陸地微生物菌種的篩選?