[發明專利]零背景克隆載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410520443.3
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104313044B
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 鄒愛蘭;俞萍;李曉晨;孫克非
• 申請（專利權）人: 天根生化科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體地，涉及零背景克隆載體及其制備方法和應用，更具體地，本發明涉及制備零背景克隆載體的方法、零背景克隆載體及其在制備目的基因克隆載體中的用途，以及制備目的基因克隆載體的方法。

背景技術

現階段的遺傳工程涉及大量的基因克隆技術，將基因片段插入到克隆載體中，方便長期保存基因以及下游的分子生物學操作。市場上常見的克隆載體比如帶胸腺嘧啶T突出末端的載體(以下簡稱T載體)大多是應用β-半乳糖苷酶基因進行藍-白斑篩選，劣勢在于藍白斑比例較高，且白斑中也存在假陽性的情況，每個平板上涂上5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(以下簡稱X-Gal)及異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(以下簡稱IPTG)的步驟也比較繁瑣。T載體只能直接連接末端帶有腺嘌呤堿基A尾的脫氧核糖核酸(以下簡稱DNA)片段，Taq酶等類似的聚合酶的保真度不如高保真酶，擴增出的片段存在錯配的風險。當插入片段大于3千堿基時候，克隆效率非常低下。

而除了T載體之外，目前也有一些有關含毒性基因的零背景載體的報道，這種新型的零背景平端克隆載體可以避免一些常見載體的缺點。但是，利用毒性基因構建載體時，為了擴繁質粒載體，一般采用阻斷序列將毒性基因的閱讀框破壞使基因不能表達，從而有可能導致存在微量未酶切干凈的質粒的干擾，對載體的質量有一定影響。

因而，現階段急需一種能夠有效解決上述問題的零背景平端克隆載體。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠直接用于平末端產物的連接，降低載體自連的背景，提高克隆的陽性率，并能夠在短時間內實現快速有效的克隆的零背景克隆載體。

首先，需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

核糖核酸酶基因(氨基酸序列如SEQ ID NO；1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，來源于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，編碼一種核糖核酸酶，可以降解核糖核酸(以下簡稱RNA)，在沒有其抑制蛋白時對細胞來說是致死的。例如，在基因克隆載體中常用的復制子能夠在大腸桿菌中高效的復制，每個細胞中拷貝達到200－300個，但是，在乳糖啟動子(以下簡稱Lac啟動子)、乳糖和色氨酸的雜合啟動子(以下簡稱Tac啟動子)，以及突變的乳糖啟動子形式(以下簡稱Lac UV5啟動子)等啟動子驅動下，核糖核酸酶基因可以大量表達，將殺死大腸桿菌細胞，因此，核糖核酸酶對普通的大腸桿菌來說都是致死的。并且，利用組織特異性表達的啟動子能夠有效驅動核糖核酸酶基因在宿主的該組織中特異表達。

細胞致死毒性(Control of cell death，以下簡稱ccdB)基因表達一種毒性蛋白，在缺乏抗毒素的情況下，干擾大腸桿菌DNA促旋酶的一種蛋白，從而抑制普通大腸桿菌的生長，殺傷宿主細胞。而DB3.1的大腸桿菌可以耐受含有ccdB基因的質粒繁殖，方便質粒的提取。利用DB3.1的大腸桿菌來繁殖載體，通過增加核糖體結合位點序列，讓ccdB基因在DB3.1菌株中高量表達，可以降低未酶切干凈載體轉化造成的背景。

發明人發現，采用雙毒基因的構建策略構建零背景克隆載體：采用ccdB毒性基因作為零背景載體的間隔序列，即通過ccdB基因的序列阻斷破壞核糖核酸酶基因(內含多克隆位點)的閱讀框，一方面可以使核糖核酸酶基因保留在載體上但不表達，當切去ccdB基因即可得到目的載體，核糖核酸酶基因就可以表達，而插入外源片段后又破壞了核糖核酸酶基因的閱讀框引起蛋白失活，從而達到零背景克隆的效果；另一方面，在載體酶切時，常常會有極少量的比如變性超螺旋的質粒酶切不完全，而通過引入ccdB基因，完整的未酶切完全的質粒將不能表達，這可以保證載體的質量。含有核糖核酸酶基因完整閱讀框的零背景克隆載體可以在自身環化后殺死大腸桿菌細胞，只有成功連接外源基因的載體才可以在平板上長出菌落。這種陽性篩選策略無需藍白篩選，能夠大大加速克隆篩選進程。

目前，尚未有使用編碼核糖核酸酶的基因來構建零背景載體進行平端克隆的報道。