[發明專利]構建測序文庫的方法及其應用

有效

• 申請號: 201410520223.0
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104294371B
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 管彥芳;錢朝陽;呂小星;常連鵬;易鑫;朱紅梅;楊玲;吳仁花
• 申請（專利權）人: 天津華大基因科技有限公司;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12Q1/68;C12M1/34
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

1.一種構建測序文庫的方法，其特征在于，包括：

(a)在雙鏈DNA片段的兩端分別連接接頭，以便獲得連接產物，其中，所述接頭包括第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈部分匹配并且所述第一鏈包含第一標簽序列，以便所述接頭上限定出雙鏈區和兩個單鏈尾部，所述兩個單鏈尾部之一的序列中包含第一標簽；

(b)將所述連接產物裂解為單鏈DNA片段；

(c)利用探針對所述單鏈DNA片段進行篩選，其中，所述探針特異性識別預定區域，其中，所述預定區域包括下列之一：

(1)MLH1、PDK1、PIGF、ROBO2、IL7R、MSH2、EP300、FYN、ASXL1、CDKN2A、KEAP1、ESR1、AXIN1、BAP1、CHUK、PTCH1、MAP2K1、CTNNA1、CYLD、SRC、XRCC1、GSTP1、ERCC1、MTHFR、SOD2、CBR3、ATIC、MTRR、DPYD、UMPS、TPMT、UGT1A1、MDR1、CDA、CYP19A1及CYP2D6基因的至少之一；

(2)(1)的CDS區域；以及

(3)(2)的上下游至少10bp的區域；

(d)利用第一引物對所述單鏈DNA片段進行鏈延伸反應，以便獲得鏈延伸產物，其中，所述第一引物包括第二標簽序列，并且所述第一引物適于與所述接頭的第一鏈形成雙鏈結構，只是所述第一標簽序列與所述第二標簽序列之間存在錯配；

(e)對所述鏈延伸產物進行擴增，以便獲得擴增產物，所述擴增產物構成所述測序文庫，其中，所述擴增采用適于同時擴增所述第一標簽序列和所述第二標簽序列的引物，所述引物為第二引物和第三引物。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述雙鏈DNA片段是通過下列步驟獲得的：

將核酸樣本進行末端修復，以便獲得經過修復的核酸樣本；以及

在所述核酸樣本的5’末端添加堿基A，以便獲得兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本，所述兩端分別具有粘性末端堿基A的核酸樣本構成所述雙鏈DNA片段。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸樣本為人基因組DNA的至少一部分或游離核酸。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述游離核酸是從患者的外周血提取的。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述患者患有癌癥，所述癌癥為選自下列的至少之一：

膀胱癌、前列腺癌、肺癌、結直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、宮頸癌、食管癌以及肝癌。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述人基因組DNA的至少一部分是通過對人基因組DNA進行隨機打斷而獲得的。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述接頭具有3’堿基T粘性末端。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單鏈DNA片段是通過將所述連接產物進行變性處理獲得的。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針是以芯片的形式提供的。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在存在UDG酶/FPG酶時，進行所述鏈延伸反應。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一標簽序列和所述第二標簽序列分別獨立地長度為4～10nt。

12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一標簽序列和所述第二標簽序列的長度均為8nt。

13.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一標簽序列和所述第二標簽序列之間存在至少2nt的錯配。

14.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述接頭的第一鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的序列，所述接頭的第二鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO：2所示的序列，所述第一標簽的核苷酸序列為SEQ ID NO：3-6中至少之一所示的序列，所述第二標簽的核苷酸序列為SEQ ID NO：7-10中至少之一所示的序列，所述第一引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：11所示的序列，所述第二引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：12所示的序列，所述第三引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：13所示的序列。