[發明專利]檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的基因芯片以及試劑盒

有效

• 申請號: 201410515392.5
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104293977B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 文心田;曹三杰;黃小波;尹人杰;文翼平;伍銳;趙松;鄧靜;常曉霞;張仙
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/93
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術領域

本發明涉及一種檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒的基因芯片以及試劑盒。

背景技術

隨著集中化養豬的規模日益擴大，豬的腹瀉疾病變得日趨嚴重。而引起仔豬腹瀉疾病的病原研究證實有而且還在不斷增加大腸桿菌、沙門氏菌、魏氏梭菌、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、溫和豬瘟、豬痢疾、豬球蟲等。而由豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒引起的仔豬病毒性腹瀉疾病日趨增多，該三類疫病能引起仔豬的高發病率和高死亡率，且有部分地區已經呈現出混合感染和繼發感染的現象，對養豬業造成了極大的損失。鑒于這三種病毒在生產中對仔豬危害極大，包括我國在內的許多國家和地區為預防和控制這三種主要的腹瀉類疫病，投入了大量的人力、物力、財力，但卻收效甚微。

由于該三類腹瀉類疫病在臨床癥狀及流行趨勢上都極其相似，尚無有效疫苗能將疫情控制，因此在臨床診斷、治療，以及防治上有極大的難度。臨川癥狀具體表現在：一般2周齡以內的仔豬感染后12-24小時會出現嘔吐，繼而出現嚴重的水樣或糊狀腹瀉，糞便呈黃色，常夾有未消化的凝乳塊，惡臭，體重迅速下降，仔豬明顯脫水，發病2-7天死亡，死亡率達100％；在2-3周齡的仔豬，死亡率在0-10％；斷乳豬感染后2-4天發病，表現水瀉，呈噴射狀，糞便呈灰色或褐色，個別豬嘔吐，在5-8天后腹瀉停止，極少死亡，但體重下降，常表現發育不良，成為僵豬；一些耐過豬和呈隱形感染的豬群往往也是帶毒豬。

傳統的檢測這三種疾病的方法如病毒分離鑒定和血清檢查，往往耗時過長。最近國外和國內均建立了RT-PCR/PCR檢測方法，以及多重PCR檢測方法，在大規模批量檢測中往往也有一定局限性。為此，有必要建立一種共檢芯片技術對豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒進行鑒別診斷，以實現對這3種病的快速且準確的檢測，為盡快采取有效的針對性防治措施，減少這些疾病對養豬業造成的損失做好鋪墊。綜上所述，用共檢芯片檢測技術對豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒進行別診斷方法是十分必要的。

伴隨分子生物學理論和技術的發展，芯片技術在檢測方面具有高通量、多樣性、微型化和自動化的優勢特點。在對各種病原體的分子檢測中，往往針對病原體的基因進行檢測。而芯片技術能對各種病原體的RNA、DNA進行定性和定量的分析，從而幫助診斷者明確疾病的種類及疾病的感染程度。因此芯片技術在傳染性疾病的診斷和病原體的篩查上發揮著越來越重要的作用。

基因芯片，又稱DNA微陣列，其原理是通過將cDNA或寡核苷酸探針密集固定于固相表面，再與已經標記好的靶基因序列進行雜交反應。經過掃描儀掃描顯示圖像和軟件處理分析數據，從而獲得檢測樣品中包含的特定分子信息，結合圖像和數據判定對應檢測樣品的是否含有、含有量的多少。傳統的檢測技術耗時費力，且難以以多病原共同檢測模式進行相關檢測。利用基因芯片技術將多種病原的特異性保守序列片段分別固定在芯片表面，與要檢測的樣品經過處理后雜交，便可獲得多種病原的檢測信息。這種檢測方法對大規模批量檢測開辟了一個新的局面，為動物疫病的綜合防治提供了有效且快速的診治平臺。

鄧俊花等，“TGEV-PEDV-PRV基因芯片探針的構建”，中國畜牧獸醫學會畜牧獸醫生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫免疫分會第七次研討會論文集，2008年7月，公開了可能用于檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的探針，但是未公開具體的基因芯片以及檢測試劑盒，也未公開其是否可以特異、靈敏地檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種特異性強、靈敏度高的可同時檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的基因芯片和試劑盒。

本發明檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的基因芯片，它包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ?ID?NO：1或2所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段，SEQ?ID?NO：3或4所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段，以及SEQ?ID?NO：5或6所示任意一個或者兩個寡核苷酸片段。

基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomic?DNA、多肽、抗體、抗原等)固著于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝膠、尼龍膜等固相遞質上形成的生物分子點陣，其突出的特點是微型化、集成化、平行化和高通量。

優選地，它還包括定位探針，定位探針是SEQ?ID?NO：19所示的基因片段。