[發(fā)明專利]一種引物對及其在俄羅斯天牛幼蟲鑒定中的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410506420.7
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN105524979A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設計）人: 顧忠盈;呂飛
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國太倉出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 賀翔

技術領域

本發(fā)明涉及天牛科幼蟲分類鑒定領域，具體涉及一種引物對及其在俄羅斯天牛幼蟲鑒定中的應用。

背景技術

天牛幼蟲的分類研究主要集中在個體形態(tài)學領域，但由于幼蟲分離鑒定資料極其缺乏，許多種類的幼蟲形態(tài)迄今尚未描述；不同地理分布的同種天牛幼蟲，形態(tài)有一定差異；親緣關系較近的種類，形態(tài)非常相似，鑒定時容易混淆。因此，隨著分子生物學的發(fā)展，核酸序列分析（DNAsequenceanalysis)被越來越多地用于天牛幼蟲的分子鑒定，在出入境檢驗檢疫工作中具有重要意義。

線粒體DNA(mtDNA)分子量較小，遵循母系遺傳，進化速率快，是分子分類學重要的標記之一。其細胞色素氧化酶I、II(COI、COII)在近緣種及種下階元的分類鑒定以及不同地理種群的遺傳變異中應用較廣。

發(fā)明內容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供了一種引物對。本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供所述的引物對在俄羅斯天牛幼蟲鑒定中的應用。

技術方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的提供的一種引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。

上游引物J1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’

下游引物N2191：5’-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’；

所述的引物對在俄羅斯天牛幼蟲鑒定中的應用。

所述的應用，將所述的引物對用于制備俄羅斯天牛幼蟲的鑒定試劑盒。

所述用于俄羅斯天牛幼蟲的鑒定試劑盒，包括：

1）預混劑A：由核苷酸序列如SEQIDNO：3的上游引物15μL，核苷酸序列如SEQIDNO：4的下游引物15μL，含有Mg^2＋的10×PCRBuffer75μL，2.5mmol/L的dNTPs60μl，TaqDNA聚合酶6μl，ddH₂O200μL組成；

2）陰性對照：非俄羅斯天牛幼蟲cDNA模板30μL；

3）陽性對照：俄羅斯天牛幼蟲cDNA模板30μL。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：本發(fā)明獲得的引物對結合第一輪引物對進行擴增，能夠成功擴增出俄羅斯天牛幼蟲COI基因的核苷酸序列，本發(fā)明優(yōu)化了克隆條件和克隆體系，制備了俄羅斯天牛幼蟲的鑒定試劑盒。該試劑盒具有較高的特異性和穩(wěn)定性，靈敏度達5pg，可以快速準確鑒定俄羅斯天牛幼蟲。因此該試劑盒可以作為快速鑒定俄羅斯天牛幼蟲的有效工具。

附圖說明

圖1：PCR方法特異性實驗的電泳圖。

具體實施方式

實施例1：試劑盒的制備。

1、試驗材料

所用天牛標本均為江蘇出入境檢驗檢疫局各口岸昆蟲實驗室多年截獲的標本。標本來源和采集時間見表1。此外，選取Genbank登錄的28種天牛COI基因序列進行比對，見表2。

表1實驗標本名稱和來源

表2Genbank下載序列信息

2、試劑

含有Mg^2＋的10×PCRBuffer，2.5mmol/L的dNTPs，TaqDNA聚合酶購自大連Takara公司；DNAMarker、GoldView購自南京上高生物公司；引物由上海金斯瑞有限公司合成。其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1、引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中28種天牛COI基因的全基因序列，使用引物設計軟件Primer5.0設計兩對特異性引物。本發(fā)明所要保護的引物對SEQIDNO：3和SEQIDNO：4為第二輪的引物對為上游引物J1718和下游引物N2191。

第一輪：J173：5’-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3’

J1331：5’-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3’；

第二輪：J1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’

N2191：5’-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’；

由上海金斯瑞有限公司合成，預期擴增片段大小約為481bp。

陽性對照：俄羅斯天牛幼蟲cDNA模板；

陰性對照：非俄羅斯天牛幼蟲cDNA模板。