[發(fā)明專利]極小單胞菌T2及其在微生物降解尼古丁中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410505852.6
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104312946B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬云;張豆;劉猛;溫榮提
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A62D3/02;A62D101/26;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株新型高效尼古丁降解菌——極小單胞菌(Pusillimonas?sp.)T2，及其在微生物降解尼古丁中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

尼古丁(nicotine)，俗稱煙堿，是一種由吡啶環(huán)和吡咯環(huán)共同組成的胺類物質(zhì)，分子式為C₁₀H₁₄N₂，尼古丁由于N-甲基四氫吡咯在吡啶環(huán)上的位置不同產(chǎn)生了α-煙堿、β-煙堿、γ-煙堿等立體異構(gòu)體，在煙草中存在的主要為β-煙堿，結(jié)構(gòu)式分別如圖8所示。純凈的尼古丁在常溫下為無色或淡黃色透明的油狀液體，有強揮發(fā)性、特殊的辛辣味和潮解性，在陽光下容易被氧化成暗灰色。在20℃時密度為1.0097g/mL，在760mm?Hg下沸點為274.5℃。尼古丁呈弱堿性，當(dāng)溫度低于60℃時，可以與水以任意比例互溶，極易溶于醇、醚、氯仿等有機溶劑，粘在皮膚表面時，很容易滲入體內(nèi)而被機體吸收。

尼古丁是一種精神藥品，具有與可卡因、海洛因一樣的成癮性，主要以煙草及其廢棄物、煙堿型農(nóng)藥、含尼古丁的藥劑以及含尼古丁的橡膠等多種形式廣泛存在于環(huán)境中。尼古丁及其代謝產(chǎn)物具有誘發(fā)多種疾病、惡化相關(guān)疾病癥狀、較強的致癌性、影響生物體的生殖和發(fā)育等生物毒性，常常引發(fā)多種危害。目前，尼古丁的生物毒性已經(jīng)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并得到了多角度、多層次的研究。

較之物理、化學(xué)的方法去除煙草及其廢棄物中的尼古丁，微生物法具有操作簡單、易改造等獨特的優(yōu)勢，越來越受到人們的關(guān)注。早在20世紀(jì)40年代，就已經(jīng)有關(guān)于微生物降解尼古丁的報道。目前國內(nèi)外的研究者已經(jīng)分離得到多株尼古丁降解菌，主要有：假單胞菌屬、秸稈菌屬、纖維單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬等。這些微生物多數(shù)能利用尼古丁為唯一碳源、氮源和能源進(jìn)行生長，它們主要通過吡啶途徑、吡咯途徑、吡啶和吡咯烷途徑的交叉途徑、脫甲基途徑將尼古丁降解并為微生物的生長提供碳源、氮源和能源，從而達(dá)到降解有毒廢物的目的。

本發(fā)明從杭州慶豐農(nóng)化有限公司采集的活性污泥中分離篩選得到一株尼古丁高效降解菌，通過對其進(jìn)行菌種鑒定和降解特性的研究，發(fā)現(xiàn)該菌株可能存在全新的降解途徑，這為更全面的了解尼古丁的降解途徑提供了依據(jù)，也為構(gòu)建具有更高降解效率和能耐受更高尼古丁濃度的工程菌建立了基礎(chǔ)。

微生物是一類種類多、繁殖快、適應(yīng)性強、代謝能力強的生物體。若能篩選并分離出高效降解尼古丁的微生物，將尼古丁降解成對人體和環(huán)境無毒害的物質(zhì)，這對維護(hù)人類健康和生態(tài)安全有著深遠(yuǎn)的意義。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一株新型高效極小單胞菌屬尼古丁降解菌—極小單胞菌T2及其在降解尼古丁中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

極小單胞菌(Pusillimonas?sp.)T2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏日期為2014年6月23日，保藏編號為CCTCC?No:M?2014272。

所述極小單胞菌T2的16S?rDNA的Genbank登陸號為KM054873，該菌株的主要生物學(xué)特征為：菌體桿狀，端生鞭毛，無芽孢，大小約為(0.5～1.0)×(1.5～2.0)μm，菌落平坦，中間凸起，邊緣擴散，呈淡黃色，革蘭氏染色呈陰性，抗氨芐青霉素、卡那霉素，慶大霉素、氯霉素、鏈霉素。該菌株最適宜的生長條件：pH值為7.0，溫度30℃。該菌株經(jīng)16S?rDNA序列分析鑒定為Pusillimonas屬，因此命名為極小單胞菌(Pusillimonassp.)T2。

本發(fā)明還涉及所述的極小單胞菌T2在微生物降解尼古丁中的應(yīng)用。

具體的，所述的應(yīng)用為：將極小單胞菌T2經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含菌發(fā)酵液離心，沉淀用pH值為7.0的磷酸緩沖液懸浮制成菌懸液作為酶源，以尼古丁為底物，于無機鹽培養(yǎng)基中，在25～45℃、pH值5.5～8.5、100～200rpm、黑暗條件下進(jìn)行降解反應(yīng)，反應(yīng)完全后(菌株活性增強后在10～16h內(nèi)即可使反應(yīng)液中尼古丁的質(zhì)量殘留量小于0.1％)，獲得尼古丁的質(zhì)量殘留量小于0.1％的培養(yǎng)液，實現(xiàn)對尼古丁的降解。優(yōu)選的，所述降解在30℃，pH?7.0、150rpm、黑暗條件下進(jìn)行。

所述尼古丁終濃度為100～1500mg/L培養(yǎng)基(優(yōu)選100mg/L)，所述酶源用量以含菌細(xì)胞數(shù)計為2×10⁶個/mL的培養(yǎng)基。

本發(fā)明所述酶源按如下步驟制備：