[發明專利]一種魚類精巢組織總RNA的提取方法

在審

• 申請號: 201410505252.X
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104212796A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 楊曉飛;徐紹剛;李文通;袁丁;楊貴強;馬峻峰
• 申請（專利權）人: 北京市水產科學研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及魚類總RNA的提取，具體地說，涉及一種魚類精巢組織總RNA的提取方法。

背景技術

總RNA分離純化技術是分子生物學研究技術的基礎，從組織中提取純度穩定、完整性好、重復性高、無污染的總RNA的分離純化方法，是決定后續實驗結果質量的關鍵，一些特定的部位使用通用的RNA分離純化方法，往往不能滿足要求，需要相應的處理與提取制備方法。

魚類精巢組織內含有大量的蛋白成分(精原細胞、精母細胞和精子等)和結締組織，采用常規RNA分離純化方法，在抽提的過程中容易蛋白污染，而且操作過程中樣本不易研磨，裂解時易產生粘稠膠團，造成抽提過程中RNA的降解和得率偏低。由于存在上述問題，使魚類精巢組織總RNA難以穩定的分離和純化。

目前，有針對性的分離純化魚精巢組織總RNA的方法較少，用傳統方法處理魚精巢組織研磨不充分、裂解易形成粘稠膠團、提取的總RNA濃度低、穩定性差、污染率高，無法滿足后續實驗的要求。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種適用于魚類精巢組織總RNA的提取方法。

為了實現本發明目的，本發明采用如下技術方案：

一種魚類精巢組織總RNA的提取方法，具體為：將魚類精巢組織經液氮速凍，Trizol裂解液處理后勻漿、過濾、離心，經蛋白酶K消化、氯仿-正丁醇混合液萃取后，再經異丙醇-醋酸鈉沉淀，DNA酶處理后，經洗滌而獲得魚類精巢組織總RNA。

進一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β-巰基乙醇和/或8-羥基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1.0-2.5％和0.10-0.15％。由于Trizol裂解液本身含有0.10％的8-羥基喹啉，因此也可不再加入8-羥基喹啉。但為了更好的抑制內源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等物質的干擾，在Trizol裂解液使用前加入0.05％8-羥基喹啉，使其在Trizol裂解液中的體積濃度達到0.15％。

進一步地，所述過濾使用35-40目濾網過濾。

作為優選，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為1/4Trizol體積。

進一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為24:1。

進一步地，在使用異丙醇-醋酸鈉沉淀RNA前，加入RNase-free的脂質體。

進一步地，在經異丙醇-醋酸鈉沉淀時，異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1。

進一步地，所述提取方法具體包括以下步驟：

1)取魚類精巢組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存；

2)將凍存樣本轉入含有Trizol裂解液的RNase-free?EP管中，勻漿后置于冰中，超聲破碎，過濾，離心，取上清；

3)加入RNase-free水稀釋，再加入蛋白酶K，振蕩搖勻，離心，取上清；

4)加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置，離心，取上清；

5)加入RNase-free的脂質體；

6)加入與步驟5)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻，離心，棄上清液；

7)用預冷的乙醇懸浮沉淀，離心，棄去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；

8)加入RNase-free?DNase緩沖液、RNase-free?DNA酶、RNA酶抑制劑和RNase-free水，處理40-50min，得到DNA酶處理液；

9)加入乙二胺四乙酸，加熱處理滅酶活，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和預冷的無水乙醇，混勻后放置15-25min，離心，棄上清；

10)用預冷的乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，室溫封閉靜置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5％的SDS溶液充分溶解，-80℃保存。

更進一步地，所述提取方法具體包括以下步驟：

1)取60-80mg魚類精巢組織，無菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速凍，-80℃超低溫凍存；

2)將凍存樣本迅速轉入含有1ml?Trizol裂解液的RNase-free?EP管中，使用RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8-10s，間隔15-20s，超聲破碎8-10s，使用35-40目過濾網過濾一次，17000-19000g?4℃離心5min，取上清；