[發明專利]一種黃曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制備方法

有效

• 申請號: 201410504590.1
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104341432A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 陳蕾;朱華玲;楊松;閆曉明
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C07D493/14
• 分類號: C07D493/14;C07K14/415;G01N33/53
• 代理公司: 福州市鼓樓區博深專利代理事務所(普通合伙) 35214
• 代理人: 林志崢

技術領域

本發明涉及一種食品安全領域，尤其涉及的是一種黃曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制備方法。

背景技術

黃曲毒素(aflatoxin)，也稱作黃曲霉素，是一種有強烈生物毒性的化合物，常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產生，如大米、豆類、花生等，是目前為止最強的致癌物質。加熱至280℃以上才開始分解，所以一般的加熱不易破壞其結構。黃曲毒素主要有B1、B2、G1與G2等4種，又以B1的毒性最強。食米儲存不當，極容易發霉變黃，產生黃曲毒素。

黃曲毒素與肝癌有密切關系，還會引起組織失血、厭食等癥狀。黃曲霉毒素中毒(Aflatoxicosis)主要對動物肝臟的傷害，受傷害的個體因動物種類年齡，性別和營養狀態而異。研究結果表明黃曲霉毒素可導致肝功能下降，降低牛奶產量和產蛋率。并使動物的免疫力降低易受有害微生物的感染。此外，長期食用含低濃度黃曲霉毒素的飼料也可導致胚胎內中毒。通常年幼的動物對黃曲霉毒素更敏感。黃曲霉毒素的臨床表現為消化系統功能紊亂降低生育能力。降低飼料利用率，貧血等。黃曲霉毒素不僅能夠使奶牛的產奶量下降而且還使牛奶中含有轉型的黃曲霉毒素M1和M2。據美國農業經濟學家統計，由于食用黃曲霉毒素污染的飼料每年至少要使美國畜牧業遭受10％的經濟損失。在中國，由此而帶來的畜牧業損失可能會更大。黃曲霉毒素Bl的半數致死量為0.36毫克/公斤體重，屬特劇毒的毒物范圍(動物半數致死量<10毫克/公斤＝它的毒性比氰化鉀大10倍比砒霜大68倍)。它引起人的中毒主要是損害肝臟，發生肝炎肝硬化，肝壞死等。黃曲霉毒素是目前發現的最強的致癌物質。其致癌力是奶油黃的900倍比二甲基亞硝胺誘發肝癌的能力大75倍，比3,4苯并芘大4000倍。它主要誘使動物發生肝癌也能誘發胃癌，腎癌直腸癌及乳腺，卵巢小腸等部位的癌癥。

因此黃曲霉毒素的檢測是農產品質量安全檢測的一個重要指標。黃曲霉毒素等真菌毒素可以通過酶聯免疫分析的方法進行檢測，而目前免疫檢測中所用的抗原載體大多是動物源的載體，不僅不夠安全，而且存在一定的免疫缺陷，如敏感性較差，特異性不夠高等問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種黃曲霉毒素半抗原、人工抗原及其制備方法。

本發明是通過以下技術方案實現的，一種黃曲霉毒素半抗原AFB1-O-CMO，分子結構式為：

一種黃曲霉毒素半抗原AFB1-O-CMO的制備方法，包括以下步驟：

(1)甲醇：雙蒸水：吡啶溶液按體積比為4:1:1的比例混合后，再將黃曲霉毒素與半羧基羥胺鹽酸CMO按質量比1:2混合后溶解于上述混合溶液中；

(2)對步驟(1)所得混合物80～90℃加熱回流3～4h，直到所有的黃曲霉毒素完全轉化為黃曲霉毒素半抗原；

(3)用旋轉蒸發儀將溶劑旋干，加水后，用2mol/L的H₂SO₄調節PH＝4，然后用5ml乙酸乙酯萃取2～3次，合并有機相，并用水洗滌至少2次，除去CMO，濃縮旋干液體，得到黃色油狀半固態物質，即為黃曲霉毒素半抗原AFB1-O-CMO。

一種黃曲霉毒素人工抗原，所述人工抗原的分子結構式為：

所述載體蛋白Protein是大豆11S球蛋白酸性亞基。

一種黃曲霉毒素人工抗原的制備方法，采用EDC活性酯法合成，具體步驟如下：

(1)將黃曲霉毒素半抗原溶于2ml體積濃度為25％乙醇溶液中，稱取4.5mg大豆11S球蛋白酸性亞基，溶于2ml純水中，黃曲霉毒素半抗原與大豆11S球蛋白酸性亞基的投料摩爾比為60:1；

(2)加入50mg的EDC，室溫下，避光攪拌反應48h；

(3)反應期間，再加入EDC各2次，每次50mg；

(4)反應產物在4℃攪拌下用PBS透析3天，每天換液3～6次，透析后得到純化的AFB1-O-AS儲存于-20℃。

所述大豆11S球蛋白酸性亞基的制備方法包括以下步驟：

(1)以1:5的體積比將大豆11S球蛋白溶于Tris-HCl緩沖液，加β巰基乙醇之后調節混合溶液的整體濃度至0.015mol.L^-1，調pH為8.0，在90℃條件下水浴30min；

(2)4℃，10000r·min^-1條件下離心20min，得到沉淀,調pH至5.0，冷凍干燥后即得大豆球蛋白堿性亞基；