[發明專利]定量檢測亞硝酸鹽和亞硝化硫醇的小分子熒光探針

有效

• 申請號: 201410503007.5
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN105439948B
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 楊有軍;沈龑鳴;張泉娟
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07D215/12
• 分類號: C07D215/12;G01N21/31;G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明涉及定量檢測亞硝酸鹽和亞硝化硫醇的小分子熒光探針，所述探針具有下式I的結構，其中R₁是?COOH、?C(O)O?C1?C4烷基、?SO₃H、?SO₂NH₂或CN；和R₂是H、C1?C4烷基?NH₂或C1?C4烷基。本發明還涉及含有所述探針的檢測組合物，檢測試劑盒，檢測樣品中的亞硝酸鹽和/或亞硝化硫醇的方法，以及所述探針或檢測組合物在檢測樣品中的亞硝酸鹽和/或亞硝化硫醇中的應用。

技術領域

本發明涉及亞硝酸鹽和亞硝化硫醇的定量檢測，具體涉及用于定量檢測亞硝酸鹽和亞硝化硫醇的小分子熒光探針。

背景技術

亞硝酸鹽(NO₂^-)不是一氧化氮生物代謝的終產物，而是在其代謝中扮演著重要的作用。在體內，亞硝酸鹽可以由多種途徑生成，其中包括：水(H₂O)或者硫醇(RSH)與三氧化二氮(N₂O₃)發生的亞硝化反應，過氧亞硝酸根(OONO^-)的還原反應，以及硝酸根(NO₃^-)的還原反應。在酸性的胃液中，亞硝酸鹽可以被轉化為一氧化氮，在胃腸道中起抗菌、抗病毒作用。在乏氧環境下，亞硝酸鹽可以被還原為一氧化氮，在乏氧血管舒張過程中起重要作用。由于亞硝酸鹽在生理及病理過程中的作用，定量檢測不同生物樣品中的亞硝酸鹽含量是非常重要的工作。另外，環境中水體的亞硝酸鹽含量是水質的一個重要指標。雖然，低濃度的亞硝酸鹽對健康是無害的甚至是有益處的，但是高濃度的亞硝酸鹽(30mg/kg)則會引起高鐵血紅蛋白癥甚至死亡。因此，實用的亞硝酸鹽檢測試劑不僅可以用于傳統領域如食品安全、疾病檢測、環境監控和司法鑒定等，還對生命科學基礎研究有重大價值。

最早也是到目前為止應用最廣泛的亞硝酸根檢測試劑是1858年開發出來的Griess試劑。該試劑通過比色法實現檢測，其檢測極限大約為0.5μM。由于一些生物樣本中的亞硝酸鹽的含量低于此檢測限，在1970年，Wiersma利用2,3-二氨基萘(DAN)開發了熒光檢測法來檢測亞硝酸鹽。檢測限達到10nM。但是，以上兩種常用試劑并不是完美的。

Griess試劑用了兩步反應來檢測亞硝酸鹽(圖1a)：首先，所加入的亞硝酸鹽會與等當量的磺胺在酸性條件下反應生成親電性的重氮化合物。接著，與隨后加入的萘乙二胺反應得到偶氮染料，進而質子化生成化合物5。該化合物呈現出的紫色(λ_abs＝540nm)則用于Griess試劑檢測亞硝酸鹽。為了簡化實驗操作，一些商用化的操作步驟會指示將含有亞硝酸鹽的樣品直接加入到化合物1和化合物3的混合溶液中。但是，這樣的操作有可能使化合物3中胺基被亞硝化，從而干擾檢測。另外，該檢測需要15分鐘或更長來使檢測反應完成。檢測通量有限。

DAN試劑的檢測同樣是兩步的檢測過程(圖1b)。在第一步反應中，DAN的酸性溶液DAN與亞硝酸鹽生成萘酚三唑。可是，在酸性條件下的萘酚三唑熒光較弱，因而需要將pH值由強酸性調至強堿性后再檢測溶液熒光強度。另外，DAN試劑檢測速度較慢。比如，亞硝酸鹽(10μM)與DAN(63nM)之間的反應需要50分鐘甚至更長才能完成。再次，DAN試劑的檢測容易受到FADH₂，FMNH₂和NADPH熒光的干擾。

因此，有必要開發檢測迅速、操作方便、高選擇性的亞硝酸鹽檢測試劑。

發明內容

因此，本發明設計了一系列選擇性高、動力學快并且使用更方便的亞硝酸鹽探針。本發明的探針可以同時用比色和熒光來實現檢測，進而可以適用于現有Griess和DAN試劑的檢測設備。

本發明的探針具有下式I所示的結構：

式I中，