[發明專利]一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法

在審

• 申請號: 201410500400.9
• 申請日: 2014-09-25
• 公開（公告）號: CN104357549A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 李燕強;韓文燦;潘志強;夏靜;許可
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法。

背景技術

一切生命組成都離不開蛋白質,而蛋白質是由核酸編碼的,因此核酸可以說是生命的基礎。核酸(如DNA)包含著所有生物機體的藍圖，對核酸序列的研究對生命科學至關重要。隨著人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的開展和完成，使人類步入了后基因時代，對當代的生物學研究和醫學研究產生了巨大的影響，分子生物學相關學科得到了迅猛的發展。人們在對核酸的研究過程中,除了關注它的序列、突變等一些定性的方面以外,還要關注它的量,因為生物體內各種基因mRNA量的變化,會導致翻譯出的蛋白質數量的改變,最終發生病理變化。故測定mRNA的量可以判斷生理病理變化情況。同樣,在臨床上，通過檢測病毒基因的數量,可以判斷病毒的復制情況。而基因表達研究、藥物篩選、藥效學評價和致病基因檢測診斷等也需要對核酸進行定量檢測。因此,在分子生物學和生物醫學中基因的定量檢測具有重要意義。

傳統的核酸定量方法,如化學發光法、分子光譜分析法以及電化學分析法由于在定量分析上準確度差而且無法對微量樣本做出分析,已不適應如今快速發展的結構分子生物學、基因組學、蛋白質組學、生物技術藥物代謝動力學等新興生命科學分支的要求。取而代之的是近年發展起來的具有高靈敏度、高通量和具有自動化分析能力的核酸定量方法,如：定量聚合酶鏈式反應技術、基因表達系列分析(Serial?Analysis?of?Expression,SAGE)、微陣列技術(Microarrays)。

隨著高量測序技術的應用，對核酸定量分析要求越來越高，目前這些核酸檢測技術，都難以達到數字化精確檢測水平。如果用這些相對落后的定量檢測技術對目前先進的測序數據進行定量分析，明顯不能滿足要求。本發明的目的就是通過在基片上直接進行單分子擴增技術，然后檢測擴增產物達到對核酸數字化定量分析。為核酸的定量分析提供一種新方法，建立快速，準確，便宜的核酸定量分析技術。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法，該方法利用每個模板DNA分子經過固相擴增后都得到了大量的分子，對這些分子的檢測很容易利用目前的熒光探針或微測序技術檢測，達到絕對定量檢測DNA目的。

本發明通過以下技術方案實現：

一種基于DNA芯片的數字化定量檢測核酸的方法，在核酸的數字化定量檢測是通過在基片上固定有擴增引物，通過單個核酸分子模版擴增目標核酸，標記探針與擴增核酸雜交檢測標記基團上的信息，或者通過微測序方法讀出擴增核酸分子信息，統計信號點數量計算出該核酸的數量。

本發明所述的檢測核酸的方法，檢測對像核酸為脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA。

本發明所述的檢測核酸的方法，所述的基片分成一個或一個以上的分區，每一個分區固定有一種引物，各區域的引物序列相同或不相同，所述的分區可以采用物理分區，即把引物固定時，每一個區域都隔開一定距離。

本發明所述的檢測核酸的方法，所述的單個模版核酸分子含有與固定在基片上的一個引物序列互補配對的一段序列，含有與目標核酸上相鄰兩段堿基序列互補配對的兩段序列，含有與標記探針上一段堿基序列互補配對的一段序列。

本發明所述的檢測核酸的方法，未知單鏈DNA模板位于溶液、平面基片、96或384孔板或修飾的珠子上，未知單鏈DNA模板通過常規的PCR，滾環擴增、固相擴增、橋式擴增以及固相酶連接反應增加其分析用數量，擴增可以是單重的，即一次擴增一個目的片斷，或者是多重的，即一次擴增多個目的片斷。

本發明所述的檢測核酸的方法，定量檢測DNA模板數量為一個或多個同時進行。

本發明的有益效果為：1)本發明的最大優點是實現對核酸分子的數字化定量分析，由于模板核酸分子通過引物固定在DNA芯片上進行固相擴增，得到的分子量大，對這些分子的檢測很容易利用目前的熒光探針或微測序技術檢測，所以操作簡單、可行性高；2)本發明的所需要的試劑和儀器均為常用，無需特殊購買，相比較傳統的數字化定量檢測核酸的方法PCR而言，擴增效率特異性高，節省擴增時間，避免了熱循環對擴增的影響。

附圖說明

圖1是用于連接成環的DNA序列結構示意圖；

圖2是圖1所示序列在連接酶體系和模板e；

圖3是圖1所示序列在連接酶體系和模板e連接成閉環結構；

圖4是固定有引物序列的DNA芯片；