[發(fā)明專利]一種膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)模型及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410499649.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN104312975B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚小紅;吳海波;卞修武;戴建武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/095
• 分類號(hào): C12N5/095;G01N33/68
• 代理公司: 北京元本知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型及應(yīng)用。所述體外三維培養(yǎng)模型的制備按照如下步驟進(jìn)行：將三維膠原支架置于DMEM培養(yǎng)基中浸泡6?24小時(shí)后取出，去除三維膠原支架上黏附的多余的DMEM得預(yù)處理三維膠原支架，將預(yù)處理三維膠原支架置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，將成球的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞種植于預(yù)處理三維膠原支架中，于37℃靜置2?6小時(shí)后，加入內(nèi)皮培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2?4天，即得到用于研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型。該體外三維培養(yǎng)模型各種操作過程均在室溫下進(jìn)行，可在原位進(jìn)行各種染色，包括免疫組化、免疫熒光染色；可進(jìn)行電鏡檢測(cè)；可直接消化后進(jìn)行RT?PCR及Western Blot檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型及應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)隔病灶的形成有賴于血液供應(yīng)，經(jīng)典的血管生成理論認(rèn)為，當(dāng)實(shí)體腫瘤長(zhǎng)至1-2mm³時(shí)，需誘導(dǎo)生成新的血管來獲取血供，否則腫瘤就會(huì)停止生長(zhǎng)。隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，近些年人們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞還可以通過自身變形、圍繞形成管腔，以一種獨(dú)立于內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管的血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)方式構(gòu)筑腫瘤微循環(huán)。自1999年Maniotis等報(bào)道了惡性黑色素瘤中存在一種腫瘤新的微循環(huán)模式血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)后，人們?cè)诼殉舶⑷橄侔⑶傲邢侔⒎伟⑽赴⒏渭?xì)胞癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤中證實(shí)了VM的存在。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤，已研究證實(shí)了膠質(zhì)瘤中也存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，而且與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)現(xiàn)象中可能起著主要的作用。

血管生成擬態(tài)與傳統(tǒng)腫瘤血管生成途徑不同，它不依賴機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，因此，在研究血管擬態(tài)形成的細(xì)胞和分子機(jī)制時(shí)，要求體外培養(yǎng)的細(xì)胞通過自身變形形成管樣結(jié)構(gòu)。但是在體外二維培養(yǎng)過程中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，細(xì)胞突起間極易相互連接，從而形成所謂的“管樣結(jié)構(gòu)”，但該結(jié)構(gòu)并非由細(xì)胞形成的管樣結(jié)構(gòu)，不能真實(shí)反映體內(nèi)血管擬態(tài)的結(jié)構(gòu)。因此，需尋找一種細(xì)胞培養(yǎng)模型可以模擬體內(nèi)血管擬態(tài)的結(jié)構(gòu)。

目前常用的研究血管新生的體外模型是Matrigel膠三維培養(yǎng)模型。但Matrigel膠實(shí)質(zhì)是一種基質(zhì)膠，僅為細(xì)胞培養(yǎng)提供基質(zhì)，而非真正意義的三維培養(yǎng)體系。此外，由于Matrigel膠自身的原因，在研究過程中發(fā)現(xiàn)其存在以下缺點(diǎn)：(1)Matrigel膠在常溫處于膠凍樣，操作必須在4℃以下的低溫環(huán)境中進(jìn)行，這會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷；(2)由于細(xì)胞在二維培養(yǎng)的某些細(xì)胞表型與三維培養(yǎng)不同，因此在研究VM時(shí)想要找到一種可以進(jìn)行原位檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)模型，但Matrigel膠不易溶解、本底易于著色等原因，不能在該培養(yǎng)模型原位進(jìn)行檢測(cè)。目前，Matrigel膠僅用來驗(yàn)證細(xì)胞是否在一定的處理?xiàng)l件下可以形成管樣結(jié)構(gòu)，這在很大程度上限制了體外血管擬態(tài)的研究進(jìn)展。因此，在腫瘤體外血管擬態(tài)研究中，亟需建立一種適合研究血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型。

發(fā)明內(nèi)容

目前應(yīng)用在制備3D細(xì)胞培養(yǎng)的主要材質(zhì)包括天然有機(jī)物和無機(jī)大分子聚合物，天然有機(jī)物有膠原、殼聚糖、葡萄糖氨基聚糖類、藻酸鹽、絲心蛋白、瓊脂糖、淀粉；無機(jī)大分子聚合物有PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己內(nèi)酯)、POE(聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究過程中預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)，采用三維膠原支架為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)支架，在體外培養(yǎng)可得到一個(gè)新的、有效的體外三維培養(yǎng)模型，制備過程中各種操作過程均在室溫下進(jìn)行，該體外三維培養(yǎng)模型可排除在Matrigel膠上由于細(xì)胞突起連接形成的管樣結(jié)構(gòu)，可在原位進(jìn)行各種染色，包括免疫組化、免疫熒光染色；可進(jìn)行電鏡檢測(cè)；可直接消化后進(jìn)行RT-PCR及Western Blot檢測(cè)，使用方便快捷，為體外血管擬態(tài)的研究提供了一種重要的工具，基于上述發(fā)現(xiàn)，從而完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞血管擬態(tài)的體外三維培養(yǎng)模型，具體的，所述體外三維培養(yǎng)模型的制備按照如下步驟進(jìn)行：