[發明專利]基因編碼的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410499305.1
• 申請日: 2011-09-26
• 公開（公告）號: CN104403003B
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發明（設計）人: 楊弋;趙玉政;呼慶勛
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 沈端

本申請是申請號201110288807.6，申請日為2011年9月26日，名為“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸基因編碼熒光探針及其制備方法和應用”的發明專利申請的分案申請。母案的全部內容在此通過引用全文納入本文用于所有目的。

技術領域

本發明涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的檢測探針，具體涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的重組熒光融合蛋白檢測探針。在一個具體方面，本發明涉及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重組熒光融合蛋白檢測探針；在另一個具體方面，本發明涉及氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重組熒光融合蛋白檢測探針；在又一方面，本發明涉及還原型和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重組熒光融合蛋白檢測探針。本發明也涉及上述檢測探針的制備方法及其分別在檢測NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的應用。

背景技術

NAD⁺及NADH作為輔酶，是呼吸鏈的重要組成部分，它參與了呼吸鏈中的電子傳遞過程(Rich,P.R.等，Biochem Soc Trans.2003，V.31(6)，pp.1095-1105)。在呼吸鏈的氧化還原反應中，NAD⁺作為質子的載體，當其接受了其他分子傳遞過來的一個電子后，由最初的氧化態轉變為還原態，該反應的最終產物為NADH，而NADH可以作為還原劑向其他分子提供電子(Belenky,P.等，Trends in Biochemical Sciences.2007,V.32(1),pp.12-19)。近來的研究表明，NAD(H)不僅參與能量代謝、物質合成以及抗氧化作用，還涉及到體內的鈣穩態、基因表達、免疫作用以及細胞衰老與死亡等等，而NAD(H)在其中均有著至關重要的作用，因此NAD(H)本身及其代謝所涉及的眾多酶類也成為了藥物設計的靶標(Sauve,A.A.等，J Pharmacol Exp Ther.2008,V.324(3),pp.883-893)。

但是，大多數活細胞內的NAD(H)的總量大約為10^-6M～10^-3M，而且NAD⁺/NADH的比例也隨著細胞內狀態不同而不盡相同(Lin,S.J.等,Current Opinion in Cell Biology.2003,V.15(2),pp.241-246)，因此這給NAD(H)的測定帶來了極大的不便。較早的檢測方法主要是利用NADH在340nm紫外光區有特征吸收，由此建立了紫外分光光度法，該方法存在兩個主要的缺陷：1、有效靈敏度受儀器精密度所限，約為10^-7M；2、在復雜體系中，不能有效地區分NADH與NADPH。隨后，根據NAD⁺作為輔酶，在電子傳遞過程中接受電子轉變為NADH的特性，發展出了一系列酶學檢測方法。其他如HPLC分析、電化學法、毛細管電泳、熒光成像等方法也常見諸于各種文獻報道中。然而，大部分的方法或者對單個細胞中靶標分子的靈敏度不足，或者不能進行亞細胞器定位。特別需要指出的是，這些現有方法均存在一個主要的缺陷，即需要對樣品進行裂解、分離、純化等操作，而NADH本身又極易氧化，在一系列繁瑣的操作中極易將誤差引入，導致最終顯示的結果與實際存在出入。另外，這些現有方法不能應用于活體動物或細胞，不能進行實時地檢測，這限制了這些方法在臨床疾病診斷及藥物前體研究等鄰域的應用。目前在活體或細胞上只能采用NADH自發熒光來檢測(Zhang,Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)，而這種傳統方法存在以下嚴重缺陷：首先，已知細胞對NAD⁺/NADH和NADP⁺/NADPH的調控是相對獨立的，正常狀態下NAD⁺/NADH的比例大約在700:1，而NADP+/NADPH的比例在1:200；其次，它們的氧化還原勢存在著巨大的區別，這反映出NADH與NADPH分別在能量代謝與合成代謝中扮演截然不同的角色；第三，NADH與NADPH自發熒光完全不可區分，利用自發熒光進行成像測量獲得的結果是NADH與NADPH之和，鑒于NADH含量很低且大部分以蛋白質結合形式存在，所以NADH自發熒光數據實質反映的是蛋白質結合的NADPH的濃度(Zhang，Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)；第四，由于NADH激發波長位于紫外區(340nm)且自發熒光較弱，需要復雜昂貴的儀器如用于臨床監測的儀器CritiView，再加上紫外光對組織的穿透力很弱并會造成細胞損傷，這些光學特性嚴重制約了自發熒光監測的應用。