[發明專利]一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定磷脂酶A2的方法

在審

• 申請號: 201410497999.5
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104263715A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 江連洲;于殿宇;張春艷;宋玉卿;王俊國;鄒小雨
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種用海藻酸鈣-殼聚糖固定磷脂酶A₂的方法。

背景技術

本文所指脂質?；D移酶為一種磷脂酶A₂（PLA₂）。PLA₂是一類能夠在磷脂甘油部分的Sn-2位點選擇性斷裂酯鍵的酶，其可將磷脂水解成一系列生物活性物質；本文所指脂質?；D移酶也可將甾醇酯化為甾醇酯。PLA₂酶源來自豬胰腺，材料相對短缺，而且存在清真等宗教文化的接受問題，未推廣開；但本文所指脂質?；D移酶的來源為氣單包菌屬，不存在上述問題，易于推廣。在上世紀90年代，德國Lurgi公司最早將Enzymax工藝用于酶法脫膠工業生產，此工藝采用的酶就是穩定的PLA₂，但是酶的消耗量很大，這樣酶的重復利用便急需開發。國內也有不少相關報道，現今用于脫膠的酶主要是Novozymes公司推出的Lecitase?10L(PLA₂)，Lecitase?Novo(PLA₁)和Lecitase?Ultra(PLA₁)。其中，豬胰臟來源的磷脂酶Lecitase?10L已不用于油脂脫膠，而被更具優勢的微生物來源的Lysomax?oil(PLA₂)所代替。

但是，游離的Lysomax?oil(PLA₂)價格昂貴，消耗量為100ppm，是Lecitase?Ultra消耗量的兩倍，不易回收，而且對反應環境適應性差。而對于固定化磷脂酶A₂來講，其有以下優勢：顆粒均勻且肉眼可見，易于將固定化酶、底物與產物分開，方便產物后續的純化；酶的溫度穩定性提高，最適pH值和最適溫度改變，對溫度和pH值適應范圍增大，對抑制劑和蛋白酶敏感性降低；可以增加產物的收率，即提高油產量和甾醇酯的產量；可以重復使用多次；脂質酰基轉移酶反應條件更易得到控制；酶的使用效率高，使用成本低；相對游離酶而言，更適于產業化、連續化、自動化生產等。

制備固定化酶的方法主要有包埋、吸附、交聯法和共價鍵結合等，其中包埋法不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應條件溫和、很少改變酶分子結構、酶活力損失小等優點。海藻酸鈣、殼聚糖是最為常見的包埋材料，因此可用其來作為固定化酶的載體。海藻酸鈣、殼聚糖可與戊二醛基形成Schiff氏堿，在膠囊表面形成一層致密的保護膜，可增加微膠囊球的強度。以海藻酸鈣-殼聚糖為包埋材料，戊二醛為交聯劑，將脂質酰基轉移酶固定化，最終選擇出最優的固定化條件。

發明內容

本發明是為了解決酶法脫膠過程中，游離磷脂酶A₂消耗量大且不易回收的問題，而提出的用海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質?；D移酶（Lysomax?oil）的方法，而且至今脂質?；D移酶（Lysomax?oil）固定化的方法及其應用仍未見報道。用海藻酸鈣-殼聚糖復合載體固定化脂質酰基轉移酶（Lysomax?oil）的方法通過以下步驟實現：一、脂質?；D移酶（Lysomax?oil）的固定化；二、固定化酶酶活力的測定；三、測定酶活力進而計算酶活回收率；四、固定化條件的優化：分別在海藻酸鈣濃度0.1%～5.0%，殼聚糖濃度為0.1%～5.0%，氯化鈣濃度為0.1mol/L～2.0?mol/L，戊二醛濃度為0.1%～1.0%，交聯時間為3h~10h的條件下，通過測定固定化酶活力回收率得到最佳的固定化條件；五、采用響應面法進行分析討論最終確定最佳固定化條件。

采用海藻酸鈣-殼聚糖作為載體固定化脂質酰基轉移酶（Lysomax?oil），海藻酸鈣-殼聚糖作為載體，不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應條件溫和、很少改變酶分子結構、酶活力損失小等優點；此外，海藻酸鈣-殼聚糖固定化脂質酰基轉移酶（Lysomax?oil）最終得到的固定化酶微球機械強度好，酶的回收率可以達到80%，對于油脂精煉中的酶法脫膠工藝具有重要指導意義。

具體實施方式