[發明專利]雜交瘤細胞株FQ-B12、其產生的抗噻菌靈單克隆抗體及應用

在審

• 申請號: 201410497912.4
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104292335A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 劉鳳權;王利民;蔡佳
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及雜交瘤細胞株FQ-B12，其分泌的抗苯咪唑類殺菌劑噻菌靈的單克隆抗體及應用。

背景技術

苯咪唑類農藥是一類重要的治療性殺菌劑，由于其藥效顯著、毒性較低，被作為廣譜性內吸殺菌劑廣泛用于真菌侵染的水果生產中。據《2007農藥管理信息匯編》，多菌靈、苯菌靈和噻菌靈是苯咪唑類農藥的主要種類。這類農藥的主要毒性是致畸作用，首先由Lapras?M等在1973年提出。其殘效期較長，在自然環境中降解較慢，具有一定的富集作用。而食用這類物質達到一定劑量時對人類的身體危害較大。

我國是世界第一水果生產大國，果品安全在食品安全中占有十分重要的地位。隨著水果產業的不斷發展，水果中農藥殘留及超標嚴重危害到人們的身體健康。二苯咪唑類殺菌劑，如噻菌靈，被廣泛應用于水果等多種作物生長期和儲存期真菌性病害的防治，若使用不當會在水果及水果制品中造成較大殘留。因此，開展水果中噻菌靈農藥殘留監測，對掌握水果農藥殘留狀況，提高果品質量和保護消費者身體健康，具有重要作用。

目前，農藥的殘留檢測多采用薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等方法。這些方法的檢測限低、靈敏度高，已有相關的技術標準可供參考，但由于需要昂貴的儀器、專門的操作人員，以及樣品前處理復雜、成本高、時間長，因此不能更好地滿足快速簡便的現場檢測要求。

免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、特異的優點，可便攜而進行現場監測。克服了傳統檢測方法的缺點。要建立免疫檢測方法，特別是針對農藥小分子的免疫檢測方法，篩選出高效單克隆抗體最為關鍵。本發明即為實現環境與農產品中苯咪唑類殺菌劑噻菌靈的免疫檢測方法，化學合成針對噻菌靈的多種半抗原，與載體蛋白結合成為免疫原或包被源，并篩選出能夠分泌針對噻菌靈的高效單克隆抗體的雜交瘤細胞株FQ-B12。并利用該雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體建立了針對環境與農產品中噻菌靈的酶聯免疫檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供雜交瘤細胞株FQ-B12，其分泌的抗苯咪唑類殺菌劑噻菌靈的單克隆抗體及應用。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

1.半抗原制備

1.1?2-(2′-丁二酰胺基-4′-噻唑)苯咪唑(H1)的合成

①2-氨基噻唑-4-甲酸乙酯：稱取1.216g硫脲溶于40mL乙腈中，待基本溶解后，向其中滴加3.12g溴代丙酮酸乙酯(195g/mol，2mL)，常溫攪拌反應過夜。將不溶物濾出，把濾液旋干，往旋干物中加入3mL左右的水，放入冰箱，過夜。有白色針狀物析出，將其濾出，干燥，得1.85g產物。

②2-氨基噻唑-4-甲酸：將1步中所得酯1.85g(172g/mol)溶于甲醇，向其中加入NaoH約0.8g，常溫攪拌反應過夜。若室溫較低，可稍微加熱。過夜后，向反應液中滴加2mol/L?HCl，至pH到3-4為止。此時有黃色固體析出，將其濾出，干燥，得產物0.91g。

③2-(2′-氨基-4′-噻唑)苯咪唑：將2步中所得酸0.91g(144g/mol)加到50mL錐形瓶中，再加入等摩爾的鄰苯二胺0.6825g(108g/mol)，再加入多聚磷酸約3mL，將其混合均勻。放入微波爐內反應。先低溫160w(1min+1min)使固體溶解在多聚磷酸里，再加大瓦數至200w，每次2min間隔照射，照射4次。待反應結束后，向反應液中加入冰水，用2mol/L?NaoH調節pH至9-10，此時固體析出，將其濾出，干燥，得產物0.68g。

1.2?5-琥珀酰胺基-2-(4-噻唑)苯咪唑(H2)：

①噻唑-4-甲酸乙酯：稱取2g(44mmol)甲酰胺加入10mL苯中，室溫攪拌下加入1.4g(6.3mmol)P₂O₅，在25℃下攪拌3h。升溫至40℃，緩慢滴加溴代丙酮酸乙酯2mL(12.75mmol)，然后升溫至回流，反應2h。反應結束后加入適量水，用1mol/L的NaOH溶液中和至pH值為8，用苯萃取，旋干苯，得油狀物1.7g(10.8mmol)。產率84.7％。

②噻唑-4-甲酸：將1步中所得酯1.7g(10.8mmol)溶于甲醇，向其中加入NaOH約0.4g，常溫攪拌反應過夜。若室溫較低，可稍微加熱。過夜后，向反應液中滴加2mol/L?HCl，至pH到3-4為止。此時有黃色固體析出，將其濾出，干燥，得產物0.98g(7.6mmol)。產率70.3％。