[發(fā)明專(zhuān)利]四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410497562.1
• 申請(qǐng)日: 2014-09-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104371986A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘洪玉;李敬濤;余剛;孫新華;劉金亮;劉言志;張祥輝;賈承國(guó)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/12
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/12;C12N15/54;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 長(zhǎng)春吉大專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及使用釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?INVSc1菌株表達(dá)與植物抗逆(具體為鹽和干旱)相關(guān)的蛋白AcGSK3，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(實(shí)時(shí)PCR，Real-Time-PCR，)的方法來(lái)研究該基因?qū)Ψ巧锩{迫NaCl和PEG的功能。

背景技術(shù)

目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中逆境脅迫是影響糧食產(chǎn)量最重要的因素和挑戰(zhàn)之一。農(nóng)作物在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)中，會(huì)受到各種逆境因素的影響，如生物脅迫的病蟲(chóng)害等，及非生物脅迫的鹽、堿、高溫、低溫、干旱等，這些脅迫限制了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，最終會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，直接影響甚至威脅到糧食安全，在這些嚴(yán)重影響作物生產(chǎn)的逆境因子中，極端溫度、干旱、高鹽、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)(包括礦物質(zhì)中毒和礦物質(zhì)缺乏)是影響作物產(chǎn)量的主要限制因子，每年直接從鹽、堿、干旱、低溫脅迫等逆境造成的農(nóng)作物減產(chǎn)仍然超過(guò)總產(chǎn)量的20％，而干旱和鹽脅迫是最主要的制約因素。因此，研究與非生物脅迫有關(guān)的基因，并將其導(dǎo)入作物進(jìn)行分子育種，引起了科研工作者的廣泛興趣，而通過(guò)基因工程的方法進(jìn)行逆境相關(guān)基因的克隆及其功能的解析，能夠?yàn)橹参锟鼓嬗N提供有價(jià)值的信息和材料。然而，從直接解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中關(guān)鍵問(wèn)題的角度來(lái)看，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上能起顯著作用的轉(zhuǎn)基因作物種類(lèi)還不多，人類(lèi)對(duì)植物逆境適應(yīng)性分子機(jī)理的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，遠(yuǎn)不能滿足植物分子育種的需求，同世界發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和具有重要利用價(jià)值的基因相對(duì)較少。同時(shí)，目前的研究也主要集中在草本植物，而對(duì)木本植物及其耐鹽和干旱的分子遺傳研究也相對(duì)較少。然而，草本和木本植物在結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)、發(fā)育、生理，及在應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫等方面存在較大的差異性。所以，從木本植物中尋找抗逆相關(guān)的基因并進(jìn)行研究，能夠?yàn)橥ㄟ^(guò)基因工程提高作物的生物和非生物脅迫耐受性這種手段提供更多的候選基因。

四翅濱藜(Atriplex?canescens[Pursh]Nute)是一種鹽生灌木，在分類(lèi)上為藜科，濱藜屬，普遍存在于干旱、半干旱地區(qū)，具有較強(qiáng)的耐干旱、抗鹽堿、耐寒冷和耐重金屬的特性，尤其是耐干旱和鹽的特性。四翅濱藜在每年降雨量最低為180mm的干旱半干旱地區(qū)，年平均氣溫僅為5℃左右的低溫地區(qū)，甚至在極端低溫為-40℃地區(qū)以及鹽堿地等惡劣環(huán)境下依然生長(zhǎng)良好，同時(shí)在海拔2000米左右的地區(qū)也適合生長(zhǎng)，根據(jù)已有報(bào)道，四翅濱藜被有些國(guó)家稱(chēng)為“生物脫鹽器”，它一年時(shí)間就可以從6.07畝的土地上吸收到1噸以上的鹽分，灌木生物量也能達(dá)到15t/hm²，枝葉中的粗蛋白含量在12％以上，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、富含營(yíng)養(yǎng)，相關(guān)科學(xué)家們認(rèn)為，四翅濱藜有及其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和可觀的飼料用途，因此成為了荒漠、半荒漠干旱地區(qū)非常有價(jià)值的優(yōu)良飼料灌木樹(shù)種。同時(shí)，四翅濱藜還具有積累硒的能力，因此在美國(guó)也廣泛用于水土保持和路坡固定，但牧場(chǎng)改良仍然是其主要用途。近年來(lái)，四翅濱藜先后在中國(guó)的新疆，甘肅，寧夏，青海和其它地方種植，通過(guò)大量研究，充分體現(xiàn)了四翅濱藜較強(qiáng)的抗鹽，堿，干旱，低溫，貧瘠等優(yōu)良特性，漸漸成為綠化和水土保持的優(yōu)良樹(shù)種。

釀酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae)具有典型的真核系統(tǒng)，是二倍體，它在蛋白翻譯后加工過(guò)程中能形成二硫鍵，具有糖基化以及蛋白折疊等特征，使得其基因表達(dá)模式更加接近于真核植物中的表達(dá)模式，它還具有生長(zhǎng)快速、遺傳操作簡(jiǎn)便和易于培養(yǎng)等的優(yōu)點(diǎn)，所以在對(duì)植物功能基因的相關(guān)研究中，用酵母表達(dá)系統(tǒng)篩選具有原核表達(dá)系統(tǒng)不可替代的優(yōu)勢(shì)性。釀酒酵母菌株INVSc1(基因型為MATa?his3D1leu2trp1-289ura3-52)是經(jīng)過(guò)人工改造后的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，該菌株的酵母轉(zhuǎn)化子運(yùn)用SC-U缺培養(yǎng)基篩選時(shí)，假陽(yáng)性低，轉(zhuǎn)化效率高，因此是理想的酵母表達(dá)菌株。利用酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株對(duì)植物cDNA文庫(kù)的研究和挖掘，在植物中受到越來(lái)越多關(guān)注。Frommer等和Hsu等(1993年)在篩選擬南芥cDNA文庫(kù)中克隆到氨基酸透過(guò)酶的NAT2/AAP1基因，該基因可以互補(bǔ)酵母的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷突變體；酵母系統(tǒng)研究植物耐鹽性表達(dá)基因的功能研究也被廣泛應(yīng)用，Yamada等(2002年)就利用酵母轉(zhuǎn)化子來(lái)驗(yàn)證丙二烯環(huán)化氧化酶(AOC)基因可以大大提高抗鹽性，進(jìn)一步推測(cè)到AOC基因在植物中也可能具有抗鹽功能。唐玉林等(2007年)利用酵母研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力得到顯著提高，從而推測(cè)SALI3-2基因所具有的抗逆能力。由此可見(jiàn)，利用酵母表達(dá)外源蛋白并研究其功能已經(jīng)受到廣泛應(yīng)用。