[發明專利]三聚氰胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 201410497218.2
• 申請日: 2014-09-25
• 公開（公告）號: CN105503757A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 吳小平;王世恩;溫凱;李向梅;陳銀輝;楊艷紅;方沅;張璐;蘇麗芳;潘靜茹;李楠;許舒婷
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: C07D251/54
• 分類號: C07D251/54;G01N21/64;C07K14/765;C07K16/44
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技術領域

本發明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法，具體涉及一種三聚氰胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用。

背景技術

三聚氰胺，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，重要的氮雜環有機化工原料。簡稱三胺，俗稱蜜胺、蛋白精，分子式C3N6H6，分子量126.12。

由于三聚氰胺的分子式中含氮量為66％左右，而蛋白質的平均含氮量為16％左右，因此，由于食品和飼料工業蛋白質含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質含量指標，俗稱“蛋白精”。雖然，目前廣泛認為三聚氰胺毒性比較低微，但長期攝入仍不容忽視。1994年國際化學品安全規劃署和歐洲聯盟委員會合編的《國際化學品安全手冊》第三卷和國際化學品安全卡片說明：長期或反復大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產生影響，導致產生結石。

2011年4月6日，國家五部委發表聯合公告，制定我國三聚氰胺在食品中的限量值。公告規定：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得銷售。這項標準與國際食品法典委員會發布的限量一致，而國際食品法典委員發布的標準被公認為食品領域的國際標準。

目前，飼料和食品中三聚氰胺殘留的檢測方法采用儀器分析法和免疫分析法。例如，酶聯免疫吸附法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質聯用法(GC-MS)和液質聯用法(LC-MS/MS)等。由于三聚氰胺屬于極強性化合物，在色譜柱上幾乎無保留，在進行分析時一般都要在流動相中加入離子對試劑來改善分離條件，在色譜柱上獲得穩定的保留；同時，由于測定的樣品中一般含有大量蛋白質，因此在進行提取時要加入蛋白質沉淀劑來除去蛋白。HPLC法具有定量準確等優點，但在檢測時前處理相對復雜，在實際應用中存在方法靈敏度低等缺點。對于三聚氰胺殘留的確證已有報道的方法有GC-MS和LC-MS/MS。由于三聚氰胺相對分子質量小于150，在進行GC-MS分析時在該質量數附近常用的毛細管氣象色譜柱柱流失產物的碎片離子很多，對質譜有嚴重干擾，因此需對三聚氰胺進行衍生化，降低背景化學噪音帶來的影響，該方法可進行確證檢測，且靈敏度高，但前處理過程復雜，需進行衍生化處理。由于LC-MS/MS法具有靈敏度高、選擇性好、定性定量準確，抗干擾能力強等優點，因此最常作為三聚氰胺殘留檢測的標準法。但該方法也存在前處理過程復雜，耗時比較長、成本高等缺點。

免疫分析法是以抗原和抗體的特異性、可逆性結合為基礎，對動物性食品中藥物或有害化合物殘留進行定量及半確證的方法。用量子點標記的二抗代替傳統的酶標二抗建立的免疫熒光分析方法具有特異性強、穩定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高、試劑穩定且有效期長(6～18個月)等優點，其檢測限比ELISA和理化檢測方法高。樣品中的三聚氰胺將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入量子點標記的二抗工作液后，用多功能酶標儀測量微孔溶液的吸光度值，將未知樣品的讀數和標準品的讀數比較，就能得到樣品中的三聚氰胺的濃度。

發明內容

本發明的目的是提供一種三聚氰胺半抗原、抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用。

本發明提供的三聚氰胺半抗原，為式Ⅰ所示的化合物；

本發明還公開了式Ⅰ所示化合物的制備方法，包括如下步驟：

12-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；

2130mg4-氨基苯甲酸鈉溶于10ml0.1mol/L碳酸氫鈉溶液后，緩慢加入上述溶液，混勻，70℃攪拌反應24h；

30.1mol/L鹽酸調pH為6，過濾，固體少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。

本發明提供的三聚氰胺抗原，是將式Ⅰ所示化合物和載體蛋白偶聯得到的偶聯物。

常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)，甲狀腺蛋白(TG)或血藍蛋白(KLH)等。

所述式Ⅰ所示化合物與BSA偶聯得到的三聚氰胺抗原的結構見圖1。

本發明還公開了所述三聚氰胺抗原制備的方法，包括如下步驟：

140mg三聚氰胺半抗原溶于5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴中加入三正丁胺38μl，攪拌反應10min，加入氯甲酸異丁酯22μl，室溫反應1h；