[發明專利]一種大腸桿菌色氨酸酶突變體及其編碼基因

有效

• 申請號: 201410494789.0
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104263714B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 徐斌;楊為華;鄧遠德;楊金環
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12Q1/527;C12Q1/04
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及生物技術制藥領域，具體地，涉及一種大腸桿菌色氨酸酶突變體及其編碼基因。

背景技術

L-色氨酸是人和動物體內的重要必需氨基酸，在醫藥、食品和飼料添加劑等方面具有廣泛的用途。其生產方法主要有蛋白水解提取法、化學合成法、微生物發酵法和酶促轉化法四種，其中酶促轉化法是目前較為有效的工業化方法。轉化途徑主要涉及色氨酸合成酶及色氨酸酶，二者均可催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸。但吲哚對前者具有強烈的抑制作用，而色氨酸酶對吲哚具有良好的穩定性，因此近年來人們更為關注色氨酸酶，并將其用于L-色氨酸的生物合成。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明目的是提供一種大腸桿菌色氨酸酶突變體及其編碼基因。

本發明提供一種大腸桿菌色氨酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由SEQ?ID?NO.1衍生的氨基酸序列。

所述色氨酸酶突變體與野生型的色氨酸酶相比，具體的氨基酸序列的改變是：T60A(第60位蘇氨酸變為丙氨酸)，V188Y(第188位纈氨酸變為酪氨酸)，A272S(第272位丙氨酸變為絲氨酸)，I348P(第348位異亮氨酸變為脯氨酸)。

本發明還提供了編碼所述大腸桿菌色氨酸酶突變體的基因。

進一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明還提供了含有所述基因的載體。

本發明還提供了含有所述基因或所述載體的宿主細胞。

本發明還提供了前述大腸桿菌色氨酸酶突變體的篩選方法，包括以下步驟:

(1)從E.coli?JM109基因組DNA中，利用引物擴增色氨酸酶的編碼基因；

(2)采用易錯PCR技術，以色氨酸酶的編碼基因為模板，擴增獲得色氨酸酶突變體基因；

(3)將步驟(2)所得易錯PCR產物及表達質粒pET28a+用Sac?I和Not?I雙酶切后連接，連接產物轉入大腸桿菌BL21感受態細胞，涂布至含卡那霉素的LB平板，將平板置37℃恒溫培養箱培養，即得構建好的重組色氨酸酶基因突變庫；

(4)LB平板上長出菌落，挑取其中的100個單克隆，轉接到LB液體培養基中，37℃搖床培養，待菌液OD₆₀₀長至0.5時，加入終濃度為0.1mM的IPTG誘導，37℃搖床繼續培養2h后，收集菌體，超聲破碎，測定色氨酸酶突變體酶活，挑選酶活力最高的一株，并測定其基因序列，分別為SEQ?ID?NO.2所示的基因序列和SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。

更進一步地，所述步驟(1)中的引物為：

正向引物：5’-GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3’；

反向引物：5’-GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3’。

本發明還提供了前述色氨酸酶突變體的制備方法，包括以下步驟：

(1)利用引物PCR擴增色氨酸酶突變體基因；

(2)將步驟(1)所得PCR產物連接表達載體pET-28a(+)；

(3)連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞，獲得表達產物。

進一步地，所述步驟(1)中所用引物為：

正向引物：5’-GATCGAGCTCATGGAAAACTTTAAACATCTCC-3’；

反向引物：5’-GATCGCGGCCGCTTAAACTTCTTTAAGTTTTGC-3’。

本發明的有益效果在于：

本發明通過易錯PCR的方法對野生型色氨酸酶基因進行改造，并且構建了高效表達載體，重組表達的色氨酸酶活力達到了原始出發菌株色氨酸酶活力的約120倍，從而為L-色氨酸的酶法生產奠定了良好的基礎。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1色氨酸酶基因的獲得