[發明專利]去除生物制品中細菌內毒素的試劑盒、方法及其生物制品的制備方法

有效

• 申請號: 201410494101.9
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104370997B
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 陳輝
• 申請（專利權）人: 陳輝
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/765;C12N15/10
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

本發明公開了一種去除生物制品中細菌內毒素的試劑盒、用該試劑盒去除生物制品中細菌內毒素的方法，以及一種去除內毒素的生物制品的制備方法，本發明的試劑盒包括陰離子表面活性劑和鉀鹽；本發明的方法是用陰離子表面活性劑與生物制品中的內毒素充分結合，形成結合物，再加入鉀鹽使結合物沉淀，過濾去除沉淀即得到去除內毒素的生物制品溶液，再從該生物制品溶液中分離出生物制品即可。本試劑盒能夠簡便、高效地去除生物制品中的內毒素、成本低，本發明的去除內毒素的方法易于操作、不影響生物制品的生物活性且只使用了醫藥工業準許使用的化合物。用發明方法制備出的生物制品，其中的內毒素含量符合臨床用藥標準、活性物質損失少。

技術領域

本發明涉及生物制品的分離純化領域，特別是涉及一種去除生物制品中細菌內毒素的試劑盒、去除方法及去除內毒素的生物制品的制備方法。

背景技術

隨著現代生物技術的廣泛應用，生物制品的安全性受到越來越多的重視，尤其是對生物制品中的熱原控制得越來越嚴格。但是在生物制品的生產過程中，常會因原輔料、生產環境以及個人操作等因素引入熱原，在采用發酵工藝的藥物生產過程中還會因為在生產過程中不可避免地需要將菌種破壁以釋放活性物質而引入大量熱原，污染生物制品。因此除了在生產環節中采取有效的工藝控制及嚴格的預防措施減少熱原的來源外，如何去除生物制品中的熱原成為本領域的重要研究課題，但是迄今為止沒有一個簡便、高效的方法。

熱原(Pyrogen)指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。通常提到的“熱原”，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌尸體及內毒素。細菌內毒素(Endotoxin)是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分之一，其本質是脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，在化學結構上主要由多糖(Polysaccharide)和類脂A(Lipid A)組成。它的特殊性在于它不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有生物活性的物質，而類脂A正是內毒素多種生物活性或毒性反應的主要基團。雖然不同的革蘭氏陰性細菌，其LPS的化學組成有一定的差別，但它們都含有類脂A部分，也就是說這個基團沒有種屬特異性，因此各屬細菌內毒素的毒性反應相似，如發熱、血液流動力學改變、彌漫性血管內凝血、休克等。因此，為保證生物制品的使用安全，需要將其中的內毒素含量降低到安全范圍內^[1][2]。比較公認的注射劑內毒素上限值是5EU/kg體重^[3]。

內毒素的化學性質非常穩定，100℃煮沸條件下不會被破壞；250℃30分鐘以上或者180℃3小時以上才能被破壞；濃度為0.1M以上的強酸或者強堿浸泡才能被破壞^[2]。在生理條件下具有疏水性和電負性，通常分子量為十幾萬至上百萬道爾頓。通常采用的去除手段有超濾、各種柱層析(如疏水層析、離子交換)、親和吸附(多粘菌素B、L-組氨酸、多聚-L-賴氨酸、多聚γ-L-谷氨酸交聯介質)和濁點萃取法(Triton X-114)等，這些方法能去除或滅活部分內毒素，但是都存在著一定的缺點。比如超濾法只能應用于小分子藥物，如果藥物分子(譬如抗體)和內毒素分子大小接近，就無法有效分離；柱層析成本高、效率很低，不適合大規模生產中細菌內毒素的去除；陰離子交換樹脂對于同樣帶負電荷的生物分子就無法分離；濁點萃取法(Triton X-114)^[4]也存在很大缺點如在操作過程中需要多次萃取，造成質粒中活性物質的損失；處理時需要轉換溫度，相變后Triton X-114形成極細小霧滴存在于水相，需要高速離心分離，難于工業化操作和控制等等。

綜上所述，研發一種既能高效率、低成本去除內毒素，又能最大限度地保持生物制品活性的方法是本領域當前的重要課題。

發明內容

本發明的主要目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，提供一種操作簡單、能夠有效去除生物制品中細菌內毒素的試劑盒；試劑盒包括鉀鹽和在足量所述鉀鹽存在下不能溶于水的陰離子表面活性劑。