[發明專利]一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方法

有效

• 申請號: 201410493727.8
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104313050B
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 孫揚;向太和;韓依萱;王嫚;宋亞玲;吳玲
• 申請（專利權）人: 杭州師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;C02F3/32;C02F101/38;C02F101/36
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

1.一種清除水體有機污染物的轉基因復合型水蕹菜的培育方法，其特征在于所述方法包括：(1)無菌苗的培養：將水蕹菜種子消毒后接種在1/2MS(0)培養基上，22±2℃，光照培養至萌發小苗，剪取靠頂端的帶葉莖段作為外植體，然后將外植體轉入含0.5～2.0mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA的MS培養基上，22±2℃，光照培養，獲得無菌苗；(2)侵染菌液：將含有核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示cyp2e1基因的質粒導入發根農桿菌，篩選得到抗性菌落；將抗性菌落活化后接種至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液體培養基中，28℃，200r/min培養至OD₆₀₀為0.4-0.6，離心，沉淀用MS液體培養基懸浮，離心去除清洗液后再用MS液體培養基懸浮，制成光密度OD值為0.1-0.2菌懸液，作為侵染菌液；(3)轉基因植株的獲取：將步驟(1)培育的無菌苗轉入1/2MS(0)培養基上，22±2℃，光照培養至株高5.5-6cm時在植株的莖上刺出傷口，然后將步驟(2)制備的侵染菌液滴加在植株的傷口處，22±2℃，光照培養，在傷口處獲得轉基因毛狀不定根；(4)轉基因復合型植株：當步驟(3)獲得的毛狀不定根長達5-6cm時，將著生有毛狀不定根的莖與原植株分離剪斷并保留完整的毛狀不定根的莖，然后將著生有毛狀不定根的莖直接插入含質量濃度0.6％瓊脂的1/2MS(0)的培養基中，22±2℃，光照培養10-15天，然后打開瓶蓋練苗2-3天，取出洗去根部的瓊脂，轉移至1/2MS液體培養基中生長，即獲得轉基因復合型水蕹菜植株。

2.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步驟(1)所述水蕹菜種子消毒方法為：將水蕹菜種子進入體積濃度0.1％氯化汞水溶液中，消毒7.5min。

3.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步驟(1)所述無菌苗培養所用培養基為含0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA的MS培養基。

4.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步驟(2)所述質粒為pSLD50-6。

5.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述步驟(2)所述發根農桿菌為發根農桿菌K599。

6.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步驟(2)抗性菌落按如下方法制備：將含cyp2e1基因的質粒導入感受態發根農桿菌K599細胞，構建重組發根農桿菌K599/pSLD50-6。

7.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步驟(3)所述帶有傷口的植株按如下步驟獲取：在無菌苗莖高1-5cm處用無菌針尖刺入，形成傷口。

8.如權利要求1所述清除水體有機污染物的轉基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所述水體有機污染物為苯或三氯乙烯。