[發明專利]一種檢測小鼠內耳毛細胞的標記分子及應用

有效

• 申請號: 201410493237.8
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104313131A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 王金福;柳全文
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及一種小鼠內耳毛細胞鑒定，特別涉及一種組合式細胞標記分子鑒定小鼠內耳毛細胞的新型方法，這種方法能特異性地鑒定分離和培養的小鼠內耳毛細胞。

(二)背景技術

哺乳動物內耳的前庭和耳蝸中存在內耳干細胞，內耳干細胞具有自我更新和多分化多潛能性，體外無血清貼壁培養可以形成內耳祖細胞。將內耳祖細胞與滅活的雞胚橢圓囊間質細胞共培養，部分祖細胞可以分化成具有功能的成熟毛細胞，具有典型的毛細胞形態。

近年來的研究發現內耳干細胞具有多分化潛能，在特定的分化條件下可以發育成內耳毛細胞。首先，將內耳干細胞接種在經多聚賴氨酸預先處理好的培養皿中，無血清貼壁培養7天。RT-PCR和免疫熒光檢測表明分化之后的細胞表達內耳發育相關基因和蛋白，形成內耳祖細胞。然后將內耳祖細胞接種在滅活的雞胚橢圓囊間質細胞上。7天后，RT-PCR和免疫熒光檢測表明誘導分化后有部分細胞表達毛細胞的特異性基因和蛋白。誘導產生的毛細胞可以吸收特異性分子染料FM1-43，全細胞膜片鉗檢測發現其具有功能。內耳毛細胞是機械刺激的受體，可以將聲音刺激轉化為電信號。功能敏感性毛細胞的丟失是導致感音性耳聾的主要原因。因此，毛細胞在治療感音性耳聾方面具有重要的應用價值。

具有大量的純度較高的細胞是分子和細胞生物學研究的基礎。內耳毛細胞在內耳中數目較少；體外培養條件復雜；缺少特異性的表面蛋白，導致分離高純度的毛細胞難度很大。因此，到目前為止，對毛細胞進行的相關研究還非常少。雖然目前有研究發現了一些不同物種內耳毛細胞表達的基因，但這些基因尚缺乏較強的組織特異性，例如成鼠分離的內耳毛細胞表達的Myosin?VIIA，Espin以及Brn3c，在其他的組織中也有不同程度的表達。因此，到目前為止尚缺乏針對內耳毛細胞特異性的細胞標記分子，這對內耳毛細胞的分離和純化以及鑒定造成了一定的困難，也是內耳毛細胞應用研究方面存在的一個技術瓶頸。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種鑒定小鼠內耳毛細胞的標記分子，并采用這種細胞標記分子特異性地鑒定小鼠內耳毛細胞的方法。本發明是通過分離得到小鼠內耳耳蝸基底膜上的干細胞，在體外進行無血清懸浮培養獲得克隆的小鼠內耳干細胞。將內耳干細胞無血清貼壁培養7天，誘導分化形成內耳祖細胞。再將內耳祖細胞接種在滅活的雞胚橢圓囊間質細胞上共培養，7天后約有30-40％的內耳祖細胞分化成毛細胞。用小分子染料FM1-43特異性標志毛細胞，再通過流式細胞儀進行分選，得到純度較高的毛細胞。提取小鼠內耳毛細胞的核糖核酸(RNA)進行小鼠基因表達譜芯片檢測小鼠內耳毛細胞基因表達譜，然后篩選特異性候選基因。最后從新生小鼠中提取出如大腦、肝臟、皮膚等10個不同組織的RNA，通過RT-PCR對候選的目的基因進行特異性檢測，確定小鼠內耳祖細胞的特異性組合式細胞標記分子。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種檢測小鼠內耳毛細胞的標記分子，所述的標記分子為Chrna9(核苷酸序列為序列5所示)和Espnl(核苷酸序列為序列6所示)。

本發明還提供一種所述的檢測小鼠內耳毛細胞的標記分子在檢測小鼠內耳毛細胞中的應用，所述的應用為：從小鼠耳蝸基底膜分離單細胞，提取單細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，分別以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl反向引物作為兩對引物進行PCR擴增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物擴增產物355bp，Espnl正向引物和Espnl反向引物擴增產物759bp，則單細胞為小鼠內耳毛細胞；

Chrna9正向引物：5’-AGCTGCGTCTCCAGTCATTC-3’；

Chrna9反向引物：5’-TGCTGTCTCTACGGCTTTGA-3；

Espnl正向引物：5’-GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3’；

Espnl反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。

本發明所述檢測小鼠內耳毛細胞的標記分子按如下步驟篩選：

(1)內耳干細胞分離和成球培養

解剖小鼠獲得小鼠耳蝸基底膜后，將基底膜胰酶消化，用移液槍吹打散后，獲得單細胞，然后將單細胞懸浮在內耳干細胞培養基中，在37℃、5％CO₂孵育箱中懸浮培養5-6天，形成內耳干細胞球。

本發明分離培養的小鼠內耳干細胞陽性表達Nestin、Abcg2、Pax-2、BMP-4及BMP-7等基因。