[發明專利]雞白痢沙門氏菌的PCR檢測引物及檢測方法

在審

• 申請號: 201410492056.3
• 申請日: 2014-09-23
• 公開（公告）號: CN104846066A
• 公開（公告）日: 2015-08-19
• 發明（設計）人: 徐桂云;師冬云;鄭江霞;劉磊
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及雞白痢沙門氏菌的分子生物學檢測，具體地說，涉及雞白痢沙門氏菌的PCR檢測引物及檢測方法。

背景技術

PCR技術是近二十年發展成熟的一種體外擴增特異性DNA片段的技術，具有簡便、快速、敏感性高和特異性強等優點。因而從上世紀90年代以來開始嘗試利用該技術來檢測食品中以及臨床樣品和環境中的沙門氏菌。但到目前為止，相關的PCR技術只能鑒定到沙門氏菌屬，無法直接區分血清型，通常還需要結合生化鑒定和血清學實驗進行分型。近幾年，隨著一些沙門氏菌血清型測序的完成，國外開始有研究根據雞白痢沙門氏菌特有的基因序列進行PCR檢測，以達到特異性檢測雞白痢沙門氏菌的目的，國內相關研究較少。而目前對雞白痢沙門氏菌的特異性PCR檢測大多是根據rfbs基因進行的，例如根據第598和237位點上的堿基多態性進行檢測，但這兩個位點上的多態性還有待擴大群體驗證。2010年李求春等報道了ipaJ基因與雞白痢的Ⅲ型分泌系統有關，其特異性已得到多位學者的認可。

Soumet等(1999年)利用多重PCR結合改良MSRV培養基的方法實施腸炎沙門氏菌的特異性檢測，主要是依據沙門氏菌屬特異性片段設計引物ST11-ST15，根據sefA基因設計引物sef167-sef478，用此方法檢測了1078份雞舍環境棉拭子，證明其敏感度(95％)高于傳統方法的敏感度(92.5％)。

薛俊龍等(2011年)用雞白痢沙門氏菌fliC基因序列建立特異性PCR診斷方法，此PCR體系能檢出50pg以上的細菌DNA，陽性檢出率和敏感性均高于常規檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種可快速、準確地檢測雞白痢沙門氏菌的特異性引物及含有該引物的試劑盒。

本發明的另一目的是提供基于上述引物及試劑盒，建立雞白痢沙門氏菌的特異性PCR檢測方法。

為了實現本發明目的，本發明根據雞白痢沙門氏菌(Salmonella?Pullorum)特有的ipaJ基因(GenBank：GU949535.1)設計了一對特異性PCR引物，擴增產物大小為161bp，引物序列如下：

正向引物ipaJ-F：5’-ATTAACAGGAGGAGGCTGG-3’(Seq?ID?No.1)

反向引物ipaJ-R：5’-CCATTCCCAAAAGCCTGCAT-3’(Seq?I?D?No.2)

本發明還提供含有上述引物的用于檢測雞白痢沙門氏菌的試劑盒。

優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液等中的至少一種。

更優選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。

本發明還提供雞白痢沙門氏菌的PCR檢測方法，利用上述引物或試劑盒對雞白痢沙門氏菌進行PCR檢測。包括以下步驟：

1)提取樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，ipaJ-F和ipaJ-R為引物進行PCR擴增反應；

3)分析PCR產物。

PCR反應體系以15μl計為：

PCR反應條件為：95℃5分鐘；95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共34個循環；72℃10分鐘。

本發明提供的雞白痢沙門氏菌的PCR檢測方法，操作簡便，易于掌握，便于推廣，一般的分子實驗室都可進行，僅需2天即可完成。同時本方法具有抗干擾能力強，靈敏度高，特異性強的優點，完全可以滿足在家禽及其產品中快速、特異性檢測雞白痢沙門氏菌的需求。無論是家禽養殖場，還是禽產品加工廠，都可以選擇最近的分子實驗室進行檢測，及時確診雞白痢沙門氏菌污染情況，將經濟損失及對公共健康的危害降到最低。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中雞白痢沙門氏菌ipaJ基因特異性檢測結果；其中，M：DNA分子量標準，N：空白對照，1：大腸桿菌，2：傷寒沙門氏菌，3：豬霍亂沙門氏菌，4：腸炎沙門氏菌，5：雞傷寒沙門氏菌，6：雞白痢沙門氏菌。

圖2為本發明實施例2中雞脾臟組織中檢測雞白痢沙門氏菌結果部分膠圖；其中，M：DNA分子量標準，P：陽性對照，1-23：脾臟組織樣本。

圖3為本發明實施例3中雞蛋3個不同部位中雞白痢沙門氏菌檢測結果部分膠圖；其中，M：DNA分子量標準，P：陽性對照，1-23：蛋黃樣本。