[發明專利]一種基于恒溫指數擴增反應與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201410491409.8
• 申請日: 2014-09-23
• 公開（公告）號: CN104278088A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 張春陽;葉麗平;胡娟
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/65
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

1.一種基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)提供或配置恒溫指數擴增反應體系，擴增待測miRNA，通過恒溫指數擴增反應擴增待測miRNA，得到擴增產物，其中，所述恒溫指數擴增反應體系中包括待測樣品和擴增模板；

2)制備金屬納米顆粒，然后采用巰基修飾的捕獲探針對所述金屬納米顆粒進行標記，得到捕獲探針-金屬納米顆粒復合物；

3)提供報告分子修飾的報告探針；

4)將步驟(1)所得的擴增產物、步驟(2)所得的捕獲探針-金屬納米顆粒復合物、以及步驟(3)所述的報告探針進行混合，得到反應液，所述反應液在55～95℃下孵育2～10分鐘后，自然冷卻到室溫，離心、洗滌、去上清，再將沉淀轉移到硅片上，自然晾干后進行SERS檢測；

其中，步驟(1)所述的擴增模板、步驟(2)所述的捕獲探針、步驟(3)所述的報告探針均為單鏈脫氧核糖核苷酸，所述捕獲探針和報告探針互不相同，且不互補；

所述步驟(1)中，所述擴增模板包括X序列和T序列，所述X序列和T序列之間具有切刻內切酶的識別序列；所述X序列與待測miRNA互補，所述T序列包括C序列和R序列，所述C序列為捕獲探針的核苷酸序列，所述R序列為報告探針的序列。

2.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述恒溫指數擴增反應體系中，采用的DNA聚合酶為Phi29DNA聚合酶、Bst?DNA聚合酶大片段、VentR?exo^–DNA聚合酶或Klenow片段聚合酶。

3.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述切刻內切酶為Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI或Nt.BstNBI切刻酶。

4.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述恒溫指數擴增反應采用的時間為10～60分鐘。

5.權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述恒溫指數擴增反應體系中，采用的DNA聚合酶的濃度為0.03～0.08U/ul。

6.如權利要求1所述基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述恒溫指數擴增反應體系中，采用的切刻內切酶的濃度為0.2～0.6U/ul。

7.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述擴增模板中的T序列至少重復1次。

8.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述金屬納米顆粒的大小為12～100nm。

9.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述報告分子為染料分子。

10.如權利要求1所述的基于恒溫指數擴增與表面增強拉曼光譜檢測的miRNA檢測方法在制備miRNA檢測試劑盒中的應用。