[發(fā)明專利]一種微球免疫分離方法及簡易裝置

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410490409.6
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104212752A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉鵬;蔡國瑞;張瑩;胡佳續(xù);牛春敬;馮潔
• 申請（專利權(quán)）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12M1/12;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品微生物、環(huán)境微生物的分離方法，尤其涉及及植物病原細(xì)菌的分離純化。

背景技術(shù)

以目前植物病原細(xì)菌檢疫工作為例。植物病原細(xì)菌的檢疫工作有三個步驟：1、樣品的癥狀觀察；2、植物病原細(xì)菌的分離；3、病原菌鑒定。其中，第二個步驟即病菌的分離是工作的重點和難點，是植物病原細(xì)菌檢疫工作的關(guān)鍵。只有拿到分離純化的病原菌，才能進(jìn)行之后的鑒定工作。目前對植物病原細(xì)菌樣品進(jìn)行初篩通常采取一些分子檢測方法（如常規(guī)PCR、熒光PCR、ELISA、基因芯片、液相芯片等），這些方法只用于樣品的初篩，即初步判定樣品是否攜帶某些病原細(xì)菌，不能作為結(jié)果判定的最終依據(jù)。所以，分離獲得的目標(biāo)病原菌是檢驗結(jié)果的證據(jù)，也是植物病原細(xì)菌檢疫工作的關(guān)鍵。

目前病原菌分離的方法較多，根據(jù)植物檢疫工作需要具有快速、準(zhǔn)確等特點，若干不同方法的分離效果對照見表1。目前來看，基于免疫吸附技術(shù)的分離方法是植物病原細(xì)菌檢疫中的最有效手段。免疫磁珠法具有自動化程度高，分離效果較好的優(yōu)點，但是方法中采用的設(shè)備和耗材價格昂貴。本專利借鑒免疫磁珠分離方法的原理，設(shè)計了簡易裝置并結(jié)合平板分離方法，探尋一種新的細(xì)菌免疫分離方法，以適應(yīng)當(dāng)前植物檢疫工作需要快速、準(zhǔn)確的要求。

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發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和不足，本發(fā)明提供一種微球免疫分離方法及簡易裝置。該方法主要對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行快速、有效的分離，可應(yīng)用于食品、環(huán)境、植物中細(xì)菌的分離。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：該方法應(yīng)用球狀聚合材料（一般選用聚苯乙烯材料，直徑約0.5mm）作為載體，將捕獲目標(biāo)病原菌的抗體包被在微球上，經(jīng)過緩沖液洗滌，將包被好抗體的微球放入樣品抽提緩沖液中進(jìn)行捕獲反應(yīng)。捕獲反應(yīng)完成后，應(yīng)用本專利設(shè)計的簡易裝置，用洗滌緩沖液和無菌水洗滌微球，之后用無菌水將微球懸浮，涂平板方法將微球放置于培養(yǎng)基上，根據(jù)待捕獲目標(biāo)病原菌的生長條件進(jìn)行培養(yǎng)，48小時-72小時后觀察到微球邊緣有菌落生長，根據(jù)目標(biāo)病原菌菌落特征進(jìn)行分離純化。

涂平板方法將微球放置于培養(yǎng)基上，需要計算懸浮微球所用無菌水的量和微球數(shù)量。由于微球在水中處于漂浮狀態(tài)，在吸取微球懸浮液時須震蕩混合后迅速吸取，每個培養(yǎng)基平板放置10-15粒微球。

本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果是：本方法靈敏、高效、操作簡便、成本較低，在食品樣本、環(huán)境樣本和植物材料中細(xì)菌的分離方面有很大的應(yīng)用空間，該方法作為核心技術(shù)還能夠開發(fā)相關(guān)的細(xì)菌分離純化試劑盒，因此具有推廣應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是實施例應(yīng)用本方法，微球洗滌簡易裝置示意圖。

圖2是實施例應(yīng)用本方法，篩網(wǎng)簡易裝置示意圖。

圖3是實施例應(yīng)用本方法，微球捕獲的細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長情況示意圖。

具體實施方式

????以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

該方法應(yīng)用微球（一般選用聚苯乙烯材料，直徑約0.5mm）作為免疫捕獲載體，以篩網(wǎng)作為洗滌主要裝置，以培養(yǎng)基涂平板方法作為分離方法。采用通用的523培養(yǎng)基或者金氏B培養(yǎng)基。

以西瓜種子中分離西瓜細(xì)菌性果斑病菌的實驗為例：

實驗材料：實驗中用到的抗體、包被緩沖液、樣品抽提緩沖液為商品試劑，反應(yīng)條件參考試劑說明書，可根據(jù)樣品的不同，優(yōu)化反應(yīng)條件。本實施例為實驗研究階段，采用美國Agdia公司血清學(xué)試劑產(chǎn)品，采用的研究菌株為西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax?avenae?subsp.?citrulli）。實驗采用的微球及篩網(wǎng)洗滌裝置為公司定制材料，吸泵和膠管為自購材料。采用523平板培養(yǎng)基，無菌水為滅菌雙蒸水。

具體方法步驟如下：

（1）將西瓜細(xì)菌性果斑病菌的抗體包被于微球上（包被步驟和條件可參照試劑產(chǎn)品說明書）。將微球放置于有包被緩沖液和西瓜細(xì)菌性果斑病菌抗體的EP管中，之后將EP管固定在振蕩器上，1000次/min室溫條件下進(jìn)行震蕩包被。

（2）將包被好的微球在洗滌裝置上進(jìn)行緩沖液洗滌（步驟和條件可參照試劑產(chǎn)品說明書）。

（3）挑取西瓜種子用樣品抽提緩沖液進(jìn)行抽提（步驟和條件可參照試劑產(chǎn)

品說明書）。將充分洗滌的微球放入西瓜種子樣品抽提緩沖液中進(jìn)行捕獲反應(yīng)（1000次/min條件下進(jìn)行震蕩）。