[發明專利]一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子及制備與應用

有效

• 申請號: 201410490371.2
• 申請日: 2014-09-23
• 公開（公告）號: CN104313130B
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 邢達;周小明;朱敏君
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

通過氨基、羧基脫水縮合作用將萬古霉素修飾到氨基磁珠上，再用一端羧基活化的聚乙二醇對磁珠上剩余的氨基位點進行封閉；即得到能高效富集微生物的功能化磁性納米粒子；

所述的氨基磁珠為四氧化三鐵磁性納米微球，表面基團:-NH₂，粒徑為100～200nm，濃度為5mg/mL，分散于PBS緩沖液中；

所述的氨基、羧基脫水縮合作用的反應步驟及體系如下：

1)取氨基磁珠，進行磁富集，加入30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次并重懸于30mM/pH6的MES緩沖液中；

2)稱取萬古霉素鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；

3)將步驟1)中的氨基磁珠和步驟2)中的藥品均勻混合并加入30mM/pH6的MES緩沖液，得到混合液，反應；

4)反應完成后，對磁珠進行磁分離，30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次，并重懸于30mM/pH6MES緩沖液中，得到修飾上萬古霉素的納米磁珠；

步驟1)中所述的氨基磁珠與步驟2)中所述的萬古霉素鹽酸鹽的體積質量比為(400～425)mL：3g；

步驟2)中所述的萬古霉素鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的質量比為3:(5～7):(7～9)；

步驟3)中所述的混合液中萬古霉素鹽酸鹽的濃度為3～6g/mL。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

所述的一端羧基活化的聚乙二醇為其分子量是2000～6000。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述的封閉的反應步驟及體系如下：取上述萬古霉素修飾的納米磁珠5mL，稱取0.025g一端羧基活化的PEG，混合均勻，反應；反應完成后，對磁珠進行磁分離，30mM/pH6的MES緩沖液清洗三次，并重懸于5mL 30mM/pH6MES緩沖液中，得到萬古霉素和PEG雙重修飾的納米磁珠，即能高效富集微生物的功能化磁性納米粒子；

所述的反應的條件為20～30℃、170～190rpm反應11h～13h。

4.一種高效富集微生物的功能化磁性納米粒子，其特征在于通過權利要求1～3任一項所述的制備方法得到。

5.一種基于權利要求4所述的功能化磁性納米粒子對食品中的微生物進行高效富集和核酸檢測的方法，其特征在于具體包括如下步驟：

(1)在液體環境中對食品中的微生物進行磁富集

取一定濃度梯度的細菌菌液分散到LB培養基中，向其中加入上述功能化磁性納米粒子，震蕩反應，進行磁富集，然后進行磁分離，最后將捕獲到細菌的納米粒子重新分散到30mM/pH6的MES緩沖液中，清洗3次，收集納米粒子/細菌復合物；

(2)對富集到的細菌進行基因組分離、純化

通過酶解法對步驟(1)收集的納米粒子/細菌復合物中富集到的細菌進行裂解，然后通過磁分離將磁珠和細胞裂解液分開，再對細胞裂解液中的細菌基因組進行分離純化；

(3)對分離純化的細菌基因組進行基于PCR的核酸檢測

通過針對待測細菌進行優化設計的引物對步驟(2)中分離純化的細菌基因組進行PCR擴增，得到特定長度PCR產物，并進行凝膠電泳以及紫外照膠顯影實驗；

所述的細菌為單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)；

步驟(3)中所述的引物的序列為：

PCR上游引物：5′-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3′；

PCR下游引物：5′-GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTA-3′。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的細菌菌液、LB培養基、上述功能化磁性納米粒子和重新分散的MES緩沖液的體積比為1:9:1:1；

步驟(1)中所述的震蕩反應的條件為20～30℃、190～210rpm反應25～35min；

步驟(2)中所述的裂解的條件為56℃裂解反應30min。