[發(fā)明專利]多能干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410490078.6
• 申請日: 2014-09-23
• 公開（公告）號: CN104293730B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李天晴;蔣斌;季維智
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.用于建立三維懸浮條件下體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括用于將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為中胚層前體細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，用于將中胚層前體細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的分化培養(yǎng)基以及心肌細(xì)胞的長期維持培養(yǎng)基；

所述用于將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為中胚層前體細(xì)胞的分化培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12與IMDM的混合培養(yǎng)基、KOSR、β-巰基乙醇、谷氨酰胺、NEAA、CHIR99021和BIO；

所述用于將中胚層前體細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的分化培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12與IMDM的混合培養(yǎng)基、KOSR、β-巰基乙醇、谷氨酰胺、NEAA、IWP-2、XAV939和抗壞血酸；

所述心肌細(xì)胞的長期維持培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12與IMDM的混合培養(yǎng)基、KOSR、β-巰基乙醇、谷氨酰胺、NEAA和抗壞血酸；

在所述用于將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為中胚層前體細(xì)胞的分化培養(yǎng)基中，DMEM/F12混合IMDM的體積比為1:1-1:3；所述KOSR的濃度為2-20％；所述NEAA的濃度為0.1-2％；所述β-巰基乙醇的濃度為0.1-1％；所述谷氨酰胺的濃度為10-200mM；所述CHIR99021的濃度為1-20μM；所述BIO的濃度為1-20μM；

在所述用于將中胚層前體細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的分化培養(yǎng)基中，DMEM/F12混合IMDM的體積比為1:3-1:5；所述KOSR的濃度為2-20％；所述NEAA的濃度為0.1-2％；所述β-巰基乙醇的濃度為0.1-1％；所述谷氨酰胺的濃度為10-200mM；所述IWP-2的濃度為2-30μM；所述XAV939的濃度為1-20μM；所述抗壞血酸的濃度為5-500μg/L；

在所述心肌細(xì)胞的長期維持培養(yǎng)基中，DMEM/F12混合IMDM的體積比為1:3-1:6；所述KOSR的濃度為2-20％；所述NEAA的濃度為0.1-2％；所述β-巰基乙醇的濃度為0.1-1％；所述谷氨酰胺的濃度為10-200mM；所述抗壞血酸的濃度為5-500μg/L。

2.在三維懸浮條件下將多能干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將貼壁生長的多能干細(xì)胞消化下來，通過直徑為20-70μm的細(xì)胞篩切割成大小均一的細(xì)胞團(tuán)塊；

2)切割得到的細(xì)胞團(tuán)塊放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行三維懸浮培養(yǎng)，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5天獲得直徑為250-300μm的多能干細(xì)胞球；

3)將步驟2)的多能干細(xì)胞球除去干細(xì)胞培養(yǎng)基，在三維懸浮的條件下，添加權(quán)利要求1所述的用于將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為中胚層前體細(xì)胞的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，記為D0天；在分化培養(yǎng)的D2天，將培養(yǎng)基替換成權(quán)利要求1所述的用于將中胚層前體細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的分化培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行分化培養(yǎng)；在分化培養(yǎng)的D12天，將培養(yǎng)基替換成權(quán)利要求1所述的心肌細(xì)胞的長期維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

所述多能干細(xì)胞為非人靈長類動物胚胎干細(xì)胞、人或非人靈長類動物誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基的配方為：DMEM/F12添加KOSR、NEAA、β-巰基乙醇、谷氨酰胺和bFGF；所述KOSR的濃度為2-20％；所述NEAA的濃度為0.1-2％；所述β-巰基乙醇的濃度為0.1-1％，所述谷氨酰胺的濃度為2-5mM，所述bFGF的濃度為5-10ng/ml。