[發明專利]一種過氧化氫酶及其編碼基因和應用

在審

• 申請號: 201410482608.2
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104312990A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 胡云峰;胡夢怡;梁甲元;張云;孫愛君;鄧盾;李潔;田新朋
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種過氧化氫酶及其編碼基因和應用。

背景技術：

過氧化氫酶是催化過氧化氫分解成水和氧氣的反應的酶。在食品和醫藥行業，過氧化氫溶液作為消毒劑或殺菌劑有著廣泛的應用。在紡織工業中，常用過氧化氫進行織物漂白。殘留過氧化氫所產生的活性氧可能引起細胞老化或癌，因此需要徹底分解。傳統去除殘留過氧化氫的方法具有操作過程繁雜且時間長、浪費資源等缺點。相比而言，過氧化氫酶可以高效、環保地分解過氧化氫，并且不需添加新的化學物質，在紡織、食品、醫藥、造紙、環保、工業酶催化等領域得到廣泛應用。

目前投入工業應用的過氧化氫酶中有些存在耐熱性、耐堿性差的問題。在食品加工、纖維加工等過程中需要高溫操作環境，所以要求所使用的過氧化氫酶具有較好的熱穩定性。在處理紡織廢水時，所使用過氧化氫酶除需耐高溫外還必須耐堿。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種新的、具有較好的耐熱性和耐堿性的過氧化氫酶CAT0935。

本發明的過氧化氫酶CAT0935，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明的第二個目的是提供編碼上述過氧化氫酶CAT0935的過氧化氫酶基因orf0935，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

含有過氧化氫酶基因orf0935的克隆表達載體。

含有上述克隆表達載體的基因工程菌。

所述的基因工程菌優選為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明的第三個目的是提供上述過氧化氫酶CAT0935在分解過氧化氫中的應用。

本發明從成功的從枯草芽孢桿菌SCSIO?15121中克隆出過氧化氫酶基因orf0935，其編碼的過氧化氫酶CAT0935，具有良好的耐熱性和耐堿性，在高溫、堿性工業環境中分解過氧化氫具有較高理論和應用價值。

附圖說明：

圖1是過氧化氫酶CAT0935純化后蛋白膠結果，其中M為蛋白標準分子量marker，A為過氧化氫酶CAT0935在大腸桿菌表達的情況，B為20mM咪唑洗脫后純化的過氧化氫酶CAT0935；

圖2是過氧化氫酶CAT0935的最適溫度酶活曲線；

圖3是過氧化氫酶CAT0935的溫度穩定性酶活曲線；

圖4是過氧化氫酶CAT0935的最適pH酶活曲線；

圖5是過氧化氫酶CAT0935的pH穩定性酶活曲線。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

1、PCR擴增：按照常規方法提取枯草芽孢桿菌SCSIO?15121的基因組DNA，以其作為模板進行PCR擴增以得到過氧化氫酶基因orf0935，PCR擴增體系為：

其中：引物F:CTCGAATTCGTGAATAACAATGATGGC，引物R:CACCTCGAGTTAAACTTGTCTATCCCAATG。

PCR擴增程序如下：95℃預變性5min；94℃變性0.5min，58℃退火1min，72℃延伸lmin，循環30次；72℃延伸10min。回收擴增產物，即為過氧化氫酶基因orf0935。

2、藍白斑篩選

(I)將PCR擴增得到的過氧化氫酶基因orf0935與T載體連接后轉化入感受態細胞大腸桿菌TG1。將40μl?100mM?IPTG和40μl?X-gal混勻后涂于1‰的kana?LB培養基上。將轉化后37℃孵育1hr的菌液均勻涂于培養基上，37℃培養過夜。

(II)挑取白色單克隆接種于5ml?1‰的kana?LB培養基中，220rpm?37℃培養過夜。

(III)菌液提取質粒后用NdeI及XhoI在37℃酶切25min后進行核酸電泳驗證。

(IV)回收核酸電泳中大小為2082bp左右的DNA片段，并進行測序，該過氧化氫酶基因orf0935的序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼的過氧化氫酶CAT0935的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。回收的過氧化氫酶基因orf0935的DNA片段用于連接表達載體。

3、克隆表達