[發明專利]臨床治療級細胞治療用成纖維細胞規模化制備人類細胞外基質篩選培養方法

有效

• 申請號: 201410482323.9
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104263698A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 朱寧文;王凌儀
• 申請（專利權）人: 江蘇華億細胞組織工程有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域：

本發明屬于生物細胞技術，組織工程領域。涉及一種體外構建高模擬體內貼附環境分離篩選，皮膚細胞成纖維細胞的培養、擴增技術。獲得臨床治療級成纖維細胞應用于組織工程皮膚構建技術中的活性種子細胞。

二、背景技術介紹：

皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調節體溫維持個體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統組成的重要的一部分，而皮膚細胞是構成這器官的基本單元，皮膚細胞基礎研究領域是揭示皮膚健康、發育、預防、治療的重要科研途徑。

細胞外基質(extracellular?matrix，ECM)廣泛存在于細胞間隙的基本填充成分，是細胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達、傳遞、互惠所依賴的極其重要場所。早期研究學者認為.外基質只是一種組織內、細胞外的單純的支持結構。Hauschka和Konigsberg在1966年研究發現填充組織間隙的膠原與促進成肌細胞轉化肌管的現象。并在兩年之后，得以證明學者們才對這種穩定外物質微環境有了新的認識和思考。

Hay在11年后報道了ECM對胚胎發育過程具有重要的誘導作用。ECM影響細胞行為的現象得以關注并進行廣泛的研究，但是并沒有成型的理論基礎佐證ECM與細胞的密切關系。直到1982年有學者提出證明并建立ECM與細胞骨架和核基質之間“動態互惠”的模型。在這個模中，ECM分子與細胞表面受體互相作用，然后把信號通過細胞膜傳導進入細胞漿中，引起從細胞骨架到細胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達。

并證明這些基因的表達產物又可以反過來對ECM發生作用，今天的許多研究證實了這個模型的合理性，并且證明細胞和ECM相互作用直接參與了細胞的黏附、生長、游走、分化和程序性死(凋亡)的過程；外基質參與調節細胞因子、生長因子的活性；還能夠直接激活、啟動細胞內信號傳導機制。由于這種對細胞的調節和對信號的傳導作用。因此，我們必須充分了解細胞外基質的化學的、物理的、生物學性質和功能及其在組織的形成和修復中的作用，才能更好地應用這些生物材料構建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的“生物構架”。我們建立的高擬細胞外基質材料利用的恰是反向理論，指導我們深入開展對ECM的認也反作用得到我們可利用的干細胞，這種研究模式促進學科前行及發展。

皮膚干細胞在正常皮膚組織中含量極少，干細胞公認是一種在體內具有無限更新能力，且可分化形成相應全層組織分化細胞，體外培養具有長期生長潛能并可形成無限克隆。是愈合修復創面，皮膚更新代謝再生的重要參與者。但由于目前缺乏理想篩選方法，對干細胞進行篩選及鑒定方法報道較少。

三、皮膚細胞名稱概述

成纖維細胞(fibroblast)也稱為纖維母細胞，是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞(mesenchymal?cell)分化而來。成纖維細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，其細胞核呈規則的卵圓形，核仁大而明顯。根據不同功能活動狀態，可將細胞劃分成成纖維細胞和纖維細胞，成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質嗜弱堿性，具明顯的蛋白質合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現跟纖維細胞的互相轉化。成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損以及骨創傷的修復有著十分重要的作用。

四、成纖維細胞概述

成纖維細胞胞體較大，胞質弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松著色淺，核仁明顯。電鏡下，其胞質可見豐富的粗面內質網、游離核糖體和發達的高爾基復合體，表明它具有合成和分泌蛋白質的功能。成纖維細胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維及有機基質。它合成的前膠原蛋白分子經內切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細胞合成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經互相粘合形成膠原纖維。經檢測，這兩種細胞合成分泌的膠原纖維均是I型膠原纖維，在形態和生化結構上完全相同。處于成熟期或稱靜止狀態的成纖維細胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內質網和高爾基復合體均不發達，被稱為纖維細胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉變為幼稚的成纖維細胞，其功能活動也得以恢復，參與組織損傷后的修復。另外，在結締組織中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質細胞，它們在創傷修復等情況下可增殖分化為成纖維細胞。

五、成纖維細胞應用的特點

一般創傷修復