[發明專利]熒光定量PCR檢測組織中miR-100含量的試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201410482086.6
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104293923A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 章曉波;龔燚;楊耿;王雨濛
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及miR-100的檢測，特別涉及熒光定量PCR檢測組織中miR-100含量的試劑盒及應用。

(二)背景技術

胃癌是一種消化系統常見的惡性腫瘤，發病率高，在我國，致死率居各種惡性腫瘤之首，由于腫瘤的范圍即癌腫侵潤的深度，腹膜轉移及遠處轉移，淋巴結的轉移都與胃癌的預后有較強的相關一致性，所以，提早診斷，早治療，才是最有效的提高胃癌生存率的手段，其中，胃癌標志物的發現及應用對于提高胃癌的早期診斷率有著重大的意義。此外，胃癌的術后復發率高達61％，這也是胃癌致死率高的重要原因，目前監測胃癌術后復發有多種方法，多數特異性不高，無法對胃癌術后是否復發做出一個早期的診斷。很明顯，無論在腫瘤的的生物學研究中還是臨床實踐中，都需要一種簡單可靠的方法來特異且靈敏的檢測胃癌的發生。

MicroRNAs(miRNAs)是最近被發現的一類非編碼小RNA,研究表明，多數癌癥的發生都與miRNA的異常調控有關，miRNA的含量發生了明顯的變化，是否能以miRNA差異表達來作為區分診斷癌癥的一種手段，值得我們深入的進行研究。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種熒光定量PCR檢測組織中miR-100含量的試劑盒及其應用，根據組織中miR-100含量判斷是否為腫瘤組織。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種熒光定量PCR檢測miR-100含量的試劑盒，所述試劑盒包括總RNA提取試劑(ambion公司)，miRNA反轉錄試劑(AB公司)，miRNA熒光定量PCR試劑(AB公司)；所述miRNA反轉錄試劑包括miR-100反轉錄引物(AB公司)；所述miRNA熒光定量PCR試劑包括miR-100熒光定量PCR引物(AB公司)；所述miR-100的核苷酸序列為5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’。具體，優選試劑盒由總RNA提取試劑(ambion公司)，miRNA反轉錄試劑(AB公司)和miRNA熒光定量PCR試劑(AB公司)組成；所述miRNA反轉錄試劑包括miR-100反轉錄引物(AB公司)，所述miRNA熒光定量PCR試劑包括miR-100熒光定量PCR引物(AB公司)。

本發明還提供一種所述熒光定量PCR檢測組織中miR-100含量的試劑盒的應用，所述的應用為：利用試劑盒中的總RNA提取試劑提取待測組織或血清的總RNA，再利用試劑盒中的miRNA反轉錄試劑及miR-100反轉錄引物將提取的總RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，利用試劑盒中的miRNA熒光定量PCR試劑及miR-100熒光定量PCR引物進行熒光定量PCR反應；所述熒光定量PCR的反應程序為：95℃反應10分鐘后進行50個循環的95℃5秒，60℃1分鐘；血清中miR-100含量超過0.1fM或者組織中miR-100含量超過100fM，則為腫瘤血清或腫瘤組織。

更進一步，本發明所述熒光定量PCR檢測組織中miR-100含量的試劑盒的檢測方法具體為：

(1)使用試劑盒中總RNA提取試劑提取待測組織或者血清中的miRNA；

(2)利用試劑盒中的miRNA反轉錄試劑及miR-100反轉錄引物將提取的miRNA通過PCR反應反轉錄成cDNA；所述反轉錄PCR的反應程序為：16℃反應30分鐘，42℃反應30分鐘，最后85℃反應5分鐘；

(3)以反轉錄產物cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑及miR-100熒光定量PCR引物進行PCR反應；所述熒光定量PCR的反應程序為：95℃反應10分鐘后，進行50個循環的95℃5秒，60℃1分鐘。

(4)采用絕對定量的方法，將步驟(1)中待測組織或血清改為含miR-100標準品的混合液進行反轉錄及熒光定量PCR反應，根據含miR-100標準品的混合液中miR-100標準品的濃度對應的起飛CT值，得到miR-100含量與熒光定量PCR反應CT值之間的線性關系，繪制成濃度與CT值之間的標準曲線；根據待測樣品CT值及標準曲線，若待測血清中超過0.1fM或者待測組織中miR-100含量超過100fM，則為胃癌血清或胃癌組織，反之，則正常。

本發明以miR-100作為胃癌標志物，研制胃癌診斷試劑盒，并以大量的胃癌患者及正常組織及血清中miR-100的檢測作為驗證，發現該試劑盒能有效靈敏地鑒別胃癌患者與正常人，對于胃癌早期診斷有著重大的意義，是有效地提高胃癌生存率的手段。

本發明的有益效果主要體現在：