[發(fā)明專利]一種同時(shí)測(cè)定三種芳香族氨基酸含量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410481491.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104198643A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝晶;邱偉強(qiáng);王金鋒;楊勝平;葉藻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及檢測(cè)三種芳香族氨基酸的方法，特別涉及用高效液相色譜法—二極管陣列法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中三種芳香族氨基酸含量的方法。

背景技術(shù)

芳香族氨基酸為含有芳香環(huán)側(cè)鏈的氨基酸，包括苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、色氨酸（Tryptophane，Trp）等三種氨基酸，其中Phe和Trp屬于必需氨基酸，Tyr則屬于半必需氨基酸。芳香族氨基酸在肝、腎、神經(jīng)等疾病診斷中有很重要的作用，且它們對(duì)水產(chǎn)食品的營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味也有重要的貢獻(xiàn)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定芳香族氨基酸在蛋白質(zhì)化學(xué)研究中有非常重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定芳香族氨基酸的方法主要有高效液相色譜法、熒光分光光度計(jì)法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法等。如：陶玉貴等用毛細(xì)管電泳法測(cè)定發(fā)酵液中L-色氨酸的含量（食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（9）：140-143），唐愛(ài)國(guó)發(fā)明了一種高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定血清中芳香族氨基酸含量的方法（專利號(hào)：CN?102128893?A），陳舜勝等用HPLC?法快速測(cè)水產(chǎn)品中游離芳香族氨基酸含量的研究（上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)2013，22（4）:629-633）等；其中以HPLC衍生法為主，因其靈敏度高、設(shè)備要求適中以及操作簡(jiǎn)便。由于Phe、Tyr及Trp的熒光特性不一致，用熒光分光光度計(jì)法不能在同一波長(zhǎng)下同時(shí)對(duì)其測(cè)定；毛細(xì)管電泳法和質(zhì)譜法的分辨率較高，但也有儀器昂貴、重復(fù)性較差等不足之處。

?本發(fā)明利用Tyr、Phe和Trp含有不飽和共軛環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可用二極管陣列檢測(cè)器(Photo?Diodearray，PDA)對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定并全波長(zhǎng)掃描，一次進(jìn)樣可以得到三種芳香族氨基酸的全波段掃描圖譜，包括三種芳香族氨基酸各自的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，比常規(guī)紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器的靈敏度更高，定量更準(zhǔn)確。由于PDA?檢測(cè)器具備隨峰快速掃描的特性，在色譜分析同時(shí)能夠采集色譜流出物在每一個(gè)瞬間的光譜圖，因而可以直觀地鑒定色譜峰的純度，從而對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)作出合理取舍,?保證結(jié)果更準(zhǔn)確，定性更可靠。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的前處理復(fù)雜、靈敏度低、回收率不高、定性不準(zhǔn)確等不足，提供一種操作簡(jiǎn)單，靈敏度高、分離速度快且定量定性準(zhǔn)確，能夠同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中三種芳香族氨基酸的HPLC-PDA法，

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中三種芳香族氨基酸含量的方法，包括以下步驟：

流動(dòng)相為A?：B?=?15：85，?A為甲醇溶液，B為0.05?mol/L磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH至6.0；等度洗脫；流速：0.9?mL/min；進(jìn)樣量為30微升；柱溫為40℃。

流動(dòng)相使用前用0.45μm的水相微孔濾膜過(guò)濾后，超聲脫氣10分鐘。

色譜柱選用Waters?Atlantis?T3?C18（4.6×250mm，5μm）作為色譜固定相。

用二極管陣列檢測(cè)器掃描確定檢測(cè)三種氨基酸的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，確定Tyr、Phe和Trp的最佳紫外檢測(cè)波長(zhǎng)分別為274.5nm、256.7nm和279.3nm。

Tyr、Phe和Trp的標(biāo)準(zhǔn)溶液是用2%的高氯酸溶液溶解、混勻；分別配制濃度1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL。

用2%的高氯酸溶液提取三種芳香族氨基酸。

制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，定性定量方法、評(píng)價(jià)精密度和考察回收率。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案為：

配制流動(dòng)相，由15%的甲醇和85%磷酸鹽溶液組成，磷酸鹽溶液由0.05?mol/L磷酸二氫鉀及磷酸二氫鉀（1：1）組成，pH范圍為6.0～6.3。因采用15%的甲醇和85%磷酸鹽溶液分離出的三種待測(cè)氨基酸峰型好，且柱壓也不高，分離速度快、效率高；pH范圍為6.0～6.3對(duì)三種氨基酸的分離效果好。

以規(guī)格為4.6×250mm?i.d,?5μm的waters?C18色譜柱為固定相。

用2%的高氯酸溶液配制三種芳香族氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液。

取新鮮水產(chǎn)品肉，用2%的高氯酸溶液勻漿、超聲、離心提取，采用2%的高氯酸溶液作為提取劑，對(duì)提取水產(chǎn)品中的三種氨基酸回收率高，特別對(duì)色氨酸提取效果好。

設(shè)置流動(dòng)相流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為30微升。

將芳香族氨基酸經(jīng)色譜柱分離后，用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行分析，選擇Tyr、Phe和Trp的最佳紫外檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。