[發明專利]新型功能性磁感應性神經支架進行復合種子細胞修復方法

在審

• 申請號: 201410479568.6
• 申請日: 2014-09-18
• 公開（公告）號: CN104225680A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 羅卓荊;黃景輝;劉鐘陽;朱澍;劉靚
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/44;A61L27/50
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.新型功能性磁感應性神經支架進行復合種子細胞修復方法，其特征在于按照以下步驟進行：

步驟1：制備磁性納米微粒；

分別配制0.1mol/L的Fe³⁺及Fe²⁺溶液，在通氮氣條件下，按照Fe³⁺:Fe²⁺摩爾比為2:1混合，機械攪拌4h，向混合溶液中滴加1mol/L的NaOH溶液，直至混合溶液pH＝9.5，水浴加熱2h后靜置5h，移去上層清液，將生成的粒子減壓抽濾，用蒸餾水及無水乙醇反復進行洗滌，洗去粒子表面的雜質離子，將粒子在50℃下真空干燥，研磨過篩，得到磁性納米微粒；

步驟2：制備磁性凝膠狀混濁液；

將β-甘油磷酸鈉溶液滴定殼聚糖混濁液，使混合液最終的pH＝7.0～7.2，然后將所得的混濁液在預冷好的冷凍干燥機中凍干24h，得到殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物粉末，然后將磁性納米微粒與殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物粉末混合，加入去離子水，4℃下，15000rpm，攪拌120min，制得磁性混濁液，4℃下將磁性混濁液抽真空24h，制得磁性凝膠狀混濁液；

步驟3：制備磁性神經支架；

將磁性凝膠狀混濁液倒入管狀的磁性神經支架模具中，以小鐵夾固定成形模具的兩端，在微型調速儀下，以垂釣的方式將成形模具順軸向以2×10^-5m/s的速度緩慢浸入液氮中，對注入磁性神經支架模具中的磁性凝膠狀混濁液進行冷淋固形處理，待磁性神經支架模具完全浸入液氮后，繼續在液氮中保留10h～14h，將磁性神經支架模具連同內部注入的磁性凝膠狀混濁液一同轉入-80℃的冰箱中冷藏，冷藏24h后取出，迅速去除磁性神經支架模具兩端的鐵夾和銅管，之后放置于預冷好的冷凍干燥機中凍干36h～40h，其中冷凍干燥機設置的預冷參數為：-60℃、100mtorr；將凍干處理后的磁性神經支架模具放置于真空狀態下并升溫至0℃，保持6h，之后再升溫至24℃，保持60min，解除真空狀態，升至常溫，得到磁性神經支架，最后將磁性神經支架從磁性神經支架模具中取出；

步驟4：交聯處理；

將磁性神經支架放入京尼平和無水乙醇混合溶液中進行交聯處理，交聯時間為46h～50h，每克磁性神經支架加入20ml京尼平和無水乙醇混合溶液，交聯處理后將磁性神經支架用去離子水和質量百分濃度為95％的酒精交替清洗30min，然后置于常溫下干燥一周，最后用⁶⁰Co照射磁性神經支架，進行消毒處理，得到消毒后的磁性神經支架；

步驟5：種子細胞的分離、純化與培養；

新生SD大鼠5只，分離坐骨神經，剪碎神經組織，消化離心后，利用差速貼壁法純化培養雪旺細胞，將第三代的雪旺細胞進行S-100與DAPI免疫細胞熒光雙重染色鑒定，確定種子細胞濃度不小于95％；

步驟6：種子細胞復合在磁性神經支架后的修復；

消毒后的磁性神經支架剪成長5mm、直徑2mm的圓柱體，放入96孔板中，將種子細胞與磁性神經支架復合24h后，磁場干預處理，進行細胞修復。

2.按照權利要求1所述新型功能性磁感應性神經支架進行復合種子細胞修復方法，其特征在于：

所述步驟2中，殼聚糖混濁液制備方法為：每20mg殼聚糖加入1.2ml冰醋酸，經22h～26h的溶解處理，制得殼聚糖混濁液；

β-甘油磷酸鈉溶液制備方法為：每1mgβ-甘油磷酸鈉加入1ml去離子水，充分攪拌后，制得β-甘油磷酸鈉溶液。

3.按照權利要求1所述新型功能性磁感應性神經支架進行復合種子細胞修復方法，其特征在于：所述步驟2中磁性納米微粒與殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物粉末混合，磁性納米微粒質量為殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物粉末的10％；每100mg磁性納米微粒與殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物粉末混合物中加入5ml去離子水。

4.按照權利要求1所述新型功能性磁感應性神經支架進行復合種子細胞修復方法，其特征在于：所述步驟4中，京尼平和無水乙醇混合溶液中，京尼平占混合溶液總質量的1％。

5.按照權利要求1所述新型功能性磁感應性神經支架進行復合種子細胞修復方法，其特征在于：所述步驟6中種子細胞按照1×10⁵/每孔的密度與磁性神經支架復合。