[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410475810.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104263697B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡振波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 胡振波
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司37205
• 代理人: 尉金洪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體地說(shuō)，涉及一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生成胰島素分泌細(xì)胞的方法，屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

我國(guó)目前糖尿病的患病率已超過(guò)12%。全世界有約2億人患有輕重程度不等的糖尿病。糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要是由于胰島分泌細(xì)胞的損傷、功能障礙或機(jī)體免疫功能異常而導(dǎo)致胰島素的分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，從而使血糖升高，進(jìn)而引起全身各臟器損傷，出現(xiàn)各種并發(fā)癥。臨床治療通常是采用皮下注射胰島素的方法來(lái)降低血糖，而對(duì)于I型及部分II型糖尿病的患者來(lái)說(shuō)，這種治療方法效果并不理想，因?yàn)槠湟资共∪藢?duì)胰島素產(chǎn)生依賴性和耐藥性，且難以阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展。胰島移植雖然可以解決根本問(wèn)題，但并不能避免免疫排斥反應(yīng)，而且供源缺乏不易實(shí)施。因此，取自患者自體的干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細(xì)胞才是治療糖尿病最為理想和有效的治療方法，它既可以修復(fù)體內(nèi)損傷的胰島素分泌細(xì)胞，又可以避免疫排斥反應(yīng)和相關(guān)并發(fā)癥，達(dá)到治療糖尿病的效果，近些年來(lái)其已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。因此研發(fā)新的胰島素分泌細(xì)胞的來(lái)源也就成為了問(wèn)題的關(guān)鍵所在。

根據(jù)干細(xì)胞發(fā)育階段的不同，可將其分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞具有全能性，它能夠分化為體內(nèi)幾乎所有的組織和器官，早在2000年Reubinoft等就用胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。但是胚胎干細(xì)胞因來(lái)源有限，且無(wú)法避免倫理學(xué)、法律、道德等問(wèn)題，同時(shí)有報(bào)道稱胚胎干細(xì)胞具有致瘤性，因此胚胎干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用受到了限制。近年來(lái)許多研究表明成體干細(xì)胞也保持著向多種組織細(xì)胞分化的潛能，如間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元等，成體干細(xì)胞來(lái)源豐富，是目前研究的重點(diǎn)。近年來(lái)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的研究取得了一些突破性的進(jìn)展，已有多項(xiàng)研究表明其能分化為心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。因其來(lái)源充足，而且可以變廢為寶，故有著良好的應(yīng)用前景。

如申請(qǐng)?zhí)枮?00980117365.X（以下稱對(duì)比文件），申請(qǐng)人為SMT.G.R.多斯及SMT.K M瑪塔腎病研究所及研究中心，名稱為用于治療糖尿病的源自人脂肪組織的胰島素生產(chǎn)性間充質(zhì)干細(xì)胞的專利，公開(kāi)了一種用于從人脂肪組織中分離和分化胰島素生產(chǎn)性間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：a)將脂肪組織切成碎末，b)向上述組織中加入1型膠原酶，c)將由上獲得的內(nèi)含物置于培養(yǎng)器里的搖動(dòng)器上，d)將步驟c獲得的全部?jī)?nèi)含物離心，e)將離心后得到的上清液和沉淀物分別在含有“無(wú)異種材料的”增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中在37℃和CO₂氣氛中培養(yǎng)約10天，所述增殖培養(yǎng)基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基)、人白蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、(FGF)、丙酮酸鈉緩沖劑、抗生素和抗真菌劑組成，f)更新培養(yǎng)基但不進(jìn)行連續(xù)傳代，g)在9-10天結(jié)束時(shí)通過(guò)胰酶消化收集上述細(xì)胞，h)檢查所收集細(xì)胞的活力、無(wú)菌性、細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD45陰性、CD90/CD73陽(yáng)性細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析，i)使用分化培養(yǎng)基使所有細(xì)胞分化成胰島素表達(dá)細(xì)胞，所述分化培養(yǎng)基由DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、煙酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h)B27、N2、血清添加物、抗生素和抗真菌劑組成，j)在至少3天后，使用常規(guī)技術(shù)分離步驟(i)的細(xì)胞，而后進(jìn)行Pax-6、Isl-1、Ipf-1/pdx-1、C-肽、胰島素的測(cè)量、無(wú)菌性和活力測(cè)定。

在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下不足：應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)生成胰島素分泌細(xì)胞，因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞屬異體細(xì)胞，有一定的抗原性，輸給糖尿病病人后可能會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，且間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的生存期較短，誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的效率也不理想。

申請(qǐng)?zhí)枮?00980117365.X的發(fā)明技術(shù)采用單一膠原酶消化法分離人脂肪間充干細(xì)胞。其誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞所用誘導(dǎo)因子包括煙酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF，其所獲干細(xì)胞數(shù)量較低，誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞產(chǎn)生的陽(yáng)性細(xì)胞率較低，誘導(dǎo)效果不理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)以上不足，提供一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，克服現(xiàn)有培養(yǎng)基在誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞中誘導(dǎo)效果不理想的缺陷。采用本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可以更有效地誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞。